| 词条 | 限制片段长度多态性 |
| 释义 | § 限制片段长度多态性 DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。 § DNA分析 所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。 § RFLP技术的操作 一、 材料 基因组DNA(大于50kb,分别来自不同的材料)。 二、设备 电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸 ，eppendorf管(0.5ml)若干。 三、试剂： 1、限制性内切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。 2、5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 3、变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。 4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。 5、10×SSC：配方见第九章。 6、其它试剂：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。 四. 操作步骤 1. 基因组DNA的酶解 (1) 大片断DNA的提取详见基因组DNA提取实验,要求提取的DNA分子量大于50kb, 没有降解。 (2) 在50μl反应体系中,进行酶切反应: 5μg基因组DNA 5μl 10×酶切缓冲液 20单位（U）限制酶(任意一种) 加ddH2 O, 至50μl (3) 轻微振荡, 离心,37℃反应过夜。 (4) 取5μl反应液,0.8％琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30kb的明显亮带出现。 [注意] 未酶切的DNA要防止发生降解, 酶切反应一定要彻底。 2. Southern转移 （1） 酶解的DNA经0.8％琼脂糖凝胶电泳(可18V过夜)后EB染色观察。 （2） 将凝胶块浸没于0.25mol/L HCl中脱嘌呤, 10分钟。 （3） 取出胶块, 蒸馏水漂洗, 转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。 （4） 预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10×SSC中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物, 以10×SSC盐溶液吸印,维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。 （5） 取下尼龙膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速转至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分钟。 （6） 将膜夹于2层滤纸内, 80℃真空干燥2小时。 （7） 探针的制备和杂交见第九章分子杂交部分。 [注意] 1、 步骤（2）中脱嘌呤时间不能过长。 2、 除步骤（1）、（4）、（5）外, 其余均在摇床上进行操作。 3、步骤（4）中,当尼龙膜覆于胶上时, 绝对防止胶与膜之间有气泡发生, 加盖滤时也不应有气泡发生。 4、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP的差异，这时应该试用另一种酶。[1] |
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