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词条 逆转录PCR
释义 逆转录PCR

概念

RT-PCR 为反转录RCR(reverse transcription PCR)和实时PCR(real time PCR)共同的缩写。

逆转录PCR,或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”,由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。随后,DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成,随每个循环倍增,即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解,留下互补DNA。

RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断,并且可以用于定量监测某种RNA的含量。(检测基因表达的方法,参见Northern Blot法。)

RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别,通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。

时实PCR,属于定量PCR(Q-PCR)的一种,以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。

real time PCR 的定量使用萤光色素,目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素;另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针(probe)。

real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合,能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR(quantitative RT-PCR)”

PCR技术相关试剂

A液:变性液

B液:醋酸钠溶液

C液:酚/氯仿/异戊醇混合液(50:49:1)

D液:异丙醇

E液:75%乙醇

F液:DEPC处理的灭菌去离子水

G液:RNA酶抑制剂

H液:反转录反应液

I液:反转录酶

J液:PCR反应液

K液:Taq DNA聚合酶(0.5u/µl)

L液:矿物油

M液:50倍TAE电泳缓冲液

N液:溴化乙锭溶液

0液:上样缓冲液

PCR各步骤的目的

(一)预变性:

破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。 使DNA充分变性,减少DNA 复杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组来源的DNA模板,最好不要吝啬这个步骤。此外,在一些使用热启动Taq酶的反应中,还可激活Taq酶,从而使PCR反应得以顺利进行。

(二)变性--退火--延伸循环:

①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;

②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

(三)用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因:

1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。(当然是在反应体系一定的条件下)例如,使用taqDNA聚合酶,72度时的碱基掺入率为35-100bp/s,因此延伸速率为1kb/min。

2.根据延伸速率推得,扩增1kb以内的dna片段1min即可,而3-4kb则需要3-4min,依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min,这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。

3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外,还有一个作用是:在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用,可以直接用于TA克隆的进行。

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更新时间:2025/3/21 23:19:22