| 词条 | 离心分离 |
| 释义 | § 简介 离心分离 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。 借助于离心力，使比重不同的物质进行分离的方法。由于离心机等设备可产生相当高的角速度，使离心力远大于重力，于是溶液中的悬浮物便易于沉淀析出；又由于比重不同的物质所受到的离心力不同，从而沉降速度不同，能使比重不同的物质达到分离。 § 技术 大型离心机 将含有两种体积稍微不同的颗粒样品小心加在有轻微梯度的离心管介质的液面上(蔗糖或甘油)。离心适当时间，样品中的颗粒向管底部移动(不能离心太久，太久了两种颗粒都会沉淀到底部)，由于体积的不同，移动的区带速度不同。然后收集不同区带的样品进行分析。 离心分离密度大于1.3g/cm3的样品，如DNA、RNA，需要使用密度比蔗糖和甘油大的介质。重金属盐氯化铯(CsCl)是目前使用的最好的离心介质，它在离心场中可自行调节形成浓度梯度，并能保持稳定。蔗糖、甘油和氯化铯都是密度离心分离中的介质， 它们在性质上、使用上和原理上有什么不同？ 在速度离心时，被分离的分子越小，需要的离心速度越高。但是，离心机中影响速度高低的是转子的半径。离心力(g)是表示某种颗粒沉淀的最好方式，一般根据离心力和离心机转子的半径决定离心速度。常见细胞器离心沉淀所需的离心力列于表。 [1] 结 构 离心力 细胞核 800-1000g 线粒体 20,000-30,000g 叶绿体 20,000-30,000g 溶酶体 20,000-30,000g 微体 20,000-30,000g 粗面内质网 50,000-80,000g 质膜和光面内质网 80,000-100,000g 游离核糖体、病毒粒子 150,000-300,000g § 方法 差速离心法 它利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。 差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。 速率区带离心法 CsCl 密度梯度离心分离 速率区带离心法是在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。离心后在近旋转轴处（X1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（X2）介质的密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。 由于ρP＞ρm可知S＞0，因此该离心法的离心时间要严格控制，既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到沉淀前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。 等密度离心法 等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρm＞ρP时粒子上浮；在弯顶处ρP＞ρm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρP＝ρm，此时dx/dt为零粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。 此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用的梯度液是CsCl。 [2] § 分类 固－固分离 差速离心的原理 使固体之间相互分离的离心分离法称离心分级，设备为离心分离机。用控制离心时间的办法，使得溶液中只沉淀大颗粒,而不是所有颗粒,这样就可逐次将颗粒按大小分开。 液－液分离 不互溶的液体在离心机中因密度不同而很快分离。这种方法比重力分离时间要短得多。常用一种称为离心萃取机的装置来分离液体溶液组分。该装置由放置在圆筒转鼓中的一系列多孔同心环组成，转鼓环绕着一个筒形轴以每分钟2000～5000转的速度旋转，液体通过筒形轴进出，以径向顺流方式在转筒中流动而达到液体溶液组分的分离。 气－气分离 同位素研究中常用的手段。在高速旋转下，气体状态的同位素混合物得以相互分离。用离心分离浓缩U是有前景的方法之一。 固－液分离 常量分析中常用过滤法，半微量分析中则用离心分离法。常用的旋转装置有手摇离心机和电动离心机（通常转速为1～4千周／分），分离速度远比过滤为快。 § 应用 胶体化学 1924年瑞典的T.斯韦德贝里设计了超速离心机，这是一种以极高的角速度运转的离心机，1940年获得的离心加速度30万倍于重力加速度，它和30年代多层吸附理论的建立，以及40年代疏液胶体稳定理论的建立,可说是近半世纪中胶体化学(见胶体和表面化学)领域内的三大成就。超速离心机的分离原理是,当一个含有聚合物或巨分子的溶液，在离心力是重力的25万倍时，分子相互分离,纯溶剂留在界面以上,这个界面以一定速度向容器低部移动。若溶质的分子量不均匀，这个界面上的浓度梯度也不均匀，则那些分子量低的会落在大分子之后。用光学仪器可观察出这个界面，从而精确测定沉降速率，而每种成分的沉降速率又与其分子量有关，因而可以计算出各成分的分子量。超速离心机不仅能分离胶粒,更重要的是它能测定胶粒的沉降速率、平均分子量及混合体系的重量分布，因而在胶体化学研究（尤其是亲液胶体）中起了重大的作用。 高分子化学 超速离心机的出现为对高分子溶液的深入了解提供了一种有力的研究手段。1940年斯韦德贝里使用超速离心法测定了分子量及其分布，可直接测定几万至几百万的分子量。高分子化合物分子量测定方法的出现，极大地推动了高分子化学的发展，许多天然高分子属于单一分散体系(所有分子都持同一分子量)，对这种系统，超速离心法是最好的分子量测定法，比渗透压、光散射和粘度等测定法更好。 生物化学 细胞器沉降系数 超速离心法同样为生物化学提供了一种强有力的研究手段。斯韦德贝里应用超速离心法测量了蛋白质分子在水中的沉降速率，从而能计算蛋白质的分子量。他的一些测定结果如下：牛胰岛素：46000;人血红球：63000；人血清球：153000；章血血清：2800000；烟草花叶病毒：31400000。超速离心法还经常用于蛋白质的降解、分离、精制以及分子量分布测定。细胞研究中常用一种分带或区域离心机，用一个大容量旋转室，根据密度梯度离心分离原理来分离细胞。 离心分离法常用于：①离心过滤，借助离心作用从浆料中排除液体，浆料被引入一快速旋转的网篮中，固体留在多孔的网上，液体则受离心作用从滤饼中挤出;或利用旋转器中的离心力使轻重物质分开,重物质以稠泥浆的形式通过喷嘴流走。常用设备为离心过滤机。②离心沉降，悬浮固体在离心力作用下移向或离开旋转中心，这样就可聚集在一个区域内而被移出，可以使颗粒的沉淀时间从几小时减至几分钟。常用设备为离心沉降器。③离心捕集，用于从煤烟、空气流中分离出0.1～1 000微米的小颗粒物质，是治理空气污染的有效手段之一。常用设备为离心捕集器，也称微粒收集器、旋风除尘器。 其他应用 工业中常用离心除渣器来净化纸浆浆料，使浆料高速回转或产生回转旋涡作用，把尘粒分离出来。还常用离心干燥机，或称离心脱水机，依靠离心力将水分脱去。 § 发展 离心分离法与其他方法相结合，可以产生新的更为有效的分离方法，这是离心分离法的现代发展方向。在这方面,离心分离法与色谱法结合而产生的场流分级法(或称外力场流动分馏法)就是一个典型例子。1966年J.C.吉丁斯提出一类新的无固定相的色谱分离法，即场流分级法,或称单相色谱。这种方法的最初构思,是以离心力压迫分子于柱壁而代替固定相的保留作用，这样产生的分离方法称离心色谱，也叫沉积场流分级法。后来依据这一基本思想，以电场、磁场、热梯度等代替离心力场，得到不同的场流分级法，从而建立了一类分离方法体系。场流分级法不但对大分子和胶体有很强的分离能力,而且它也能分离分子量小于10的物质和大于30微米的远远超出胶体范围的固体颗粒，其可分离的分子量有效范围约为10～10，这样宽的连续分离范围是空前未有的。 近年来出现的离心制备薄层色谱法是离心分离法渗透于色谱领域而产生的又一种高效分离法。层析薄板为圆形，样品注射于圆心四周，从垂直于圆心的方向连续地加入展开剂,薄板旋转,各不同组分即沿径向迅速展开。在紫外灯照射下可观察到谱带的移动，由于板面设置是倾斜的，可沿斜向直接接收各分开的组分。该法已用于天然产物、合成产物及异构体等的快速分离提纯，分离效果优于制备薄层色谱和柱层色谱法，在一定程度上与制备型高压液相色谱法相似，但在节省时间和溶剂等方面优于后者。 |
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