概述

解旋酶例举

DNA解旋酶

转录需不需要解旋酶

解旋酶的工作机理

概述

解旋酶 helicase

解旋酶是一类解开氢键的酶，而不是一种酶，由水解ATP供给能量来解开DNA的酶。它们常常依赖于单链的存在，并能识别复制叉的单链结构。一般在DNA或RNA复制过程中起到催化双链DNA或RNA解旋的作用。

与解链有关的酶和蛋白质包括:1.单链结合蛋白 2.解旋酶 3.拓扑异构酶Ⅰ 4.拓扑异构酶Ⅱ。

在细菌中类似的解旋酶很多，都具有ATP酶的活性，大部分的移动方向是5'→3'，但也有3'→5'移到的情况，如n'蛋白在φχ174以正链为模板合成复制形的过程中，就是按3'→5'移动。

解旋酶例举

1、E.coli及噬菌体的解旋酶

表11-2 E.coli及噬菌体的解旋酶

解旋酶　结构　功能

DnaB　330 kD六聚体　结合于oriC,oriλ参与前引发，分离双链，水解ATP提供能量

rep蛋白　66 kD单体　ATP依赖性解旋酶，在φX174滚环复制中推进复制叉

PriA(n′蛋白)　82 kD单体　φX174Rf形成中参与前引发体3′→5′移动,取代SSB，识别特异位点

TraY/I　多聚体　F因子滚环复制中解链

基因4蛋白　58 kD　T7噬菌体复制中延5′→3′解链

合成位置：存在于核膜上的核糖体，通过核孔进入细胞核内。

2、TFⅡ-F 和TFⅡ-H（有解旋酶活性）

转录前先是TFⅡ-D与TATA盒结合; 继而TFⅡ-B以其C端与TBP-DNA复合体结合，其N端则能与RNA聚合酶Ⅱ亲和结合; 接着由两个亚基组成的TFⅡ-F加入装配，TFⅡ-F不仅能与RNA聚合酶形成复合体，还具有依赖于ATP供给能量的DNA解旋酶活性，能解开前方的DNA双螺旋，在转录链延伸中起作用. 这样，启动子序列就与TFⅡ-D、B、F及RNA聚合酶Ⅱ结合形成一个有转录功能基础的“最低限度”转录前起始复合物(pre-initiation complex，PIC)，转录mRNA. TFⅡ-H是多亚基蛋白复合体，具有依赖于ATP供给能量的DNA解旋酶活性，在转录链延伸中发挥作用; TFⅡ-E是两个亚基组成的四聚体，而可能与TFⅡ-B联系不直接与DNA结合，能提高ATP酶的活性; TFⅡ-E和TFⅡ-H的加入就形成了完整的转录复合体，能转录延伸生成长链RNA.

DNA解旋酶

DNA解旋酶（DNA helicase）

通常为流体蛋白环，通过ATP水解产生的能量由解旋酶装载器装载到DNA单链上（单链穿过环中央），有3‘--5’或5‘--3’方向极性，该极性就是它结合的单链的极性。它像DNA聚合酶一样具有延伸性。

与解旋酶装载器结合，装载到单链DNA上之前，DNA解旋酶是没有活性的，只有解旋酶装载器将它装载到单链DNA上，解旋酶装载器自动离开之后，DNA解旋酶的活性才被激活。直到双链全部解开，运动到单链末端时，它才从单链上离开。

注意DNA解旋酶结合的是DNA单链而不是双链，至于它结合的单链，是由起始子蛋白作用到被称为复制器的DNA区段使该区段发生双链解旋才产生的。

DNA解旋酶作用于DNA双链的氢键上。

转录需不需要解旋酶

下面有两类观点

1、 不需要： DNA复制需要解旋酶，可是与DNA复制相类似的转录过程并不需要解旋酶，基因的转录是由RNA聚合酶催化进行的。基因的上游具有结合RNA聚合酶的区域，叫做启动子。启动子是一段具有特定序列的DNA，具有和RNA聚合酶特异性结合的位点，决定了基因转录的起始位点。RNA聚合酶与启动子结合后，在特定区域将DNA双螺旋两条链之间的氢键断开，使DNA解旋，形成单链区，以非编码链为模板合成RNA互补链的过程就开始了。

2、需要：在真核细胞中，RNA聚合酶通常不能单独发挥转录作用，而需要与其他转录因子共同协作，有些辅助功能的转录因子就是解旋酶。

解旋酶的工作机理

1、单分子动力学研究阐释UvrD解旋酶的工作机理:

解旋酶是一种常见的马达蛋白，它以核酸单链为轨道沿着核酸链定向移动，并利用ATP水解提供的能量打开互补的核酸双链, 获得单链。解旋酶在DNA的复制、修复、重组以及转录等代谢过程都起着重要作用。但是人们迄今还没有完全理解解旋酶的解旋机制。单分子操纵技术帮助人们在单分子水平定量研究解旋酶的解旋动力学，是研究解旋酶分子机制的高端技术。大肠杆菌UvrD解旋酶是具有在DNA单链上由3′至 5′方向行走极性的解旋酶，有4个子功能域。关于UvrD各个子功能域的功能、它的解旋机制、特别是其有效的工作模式一直是争论的焦点(Cell,127(2006)1349; Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9(2008)391)。

2、单分子荧光分析技术揭示解旋酶作用机制：

类似解旋酶的蛋白与核酸相互位置的转变具有重要的细胞生物学意义，但是至今科学家们还并不清楚这个过程如何解开DNA结合蛋白，而且这一过程的基本特征迄今为止仍然倍受争议。 DNA修复指双链DNA上的损伤得到修复的现象，这个过程可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能，DNA修复是探索生命的一个重要方面，而且与遗传疾病、肿瘤学等密切相关。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。

DNA解链酶在DNA不连续复制过程中，结合于复制叉前面，催化DNA双链结构解链，并具有ATP酶活性的酶，两种活性相互偶联，通过水解ATP提供解链的能量。不同来源的DNA解旋酶的共同特性是通过水解ATP提供解链的能量，而复制叉结构的存在与否对活性的影响因酶而异》

研究人员利用单分子荧光共振能量转移技术（FRET）解析了这一过程，如下图所示，这种PcrA螺旋酶通过2B位点结合在模板链上，沿着滞后链滑动，形成一个单链环，从而反复的，统一步骤的完成功能。这个过程需要PcrA开放性的结构，能快速的替换RecA，这为分析DNA复制过程提供了一种新模型。

这个过程使用了两种染料，这些染料荧光强度可根据它们之间的靠近距离发生改变。研究人员将两种染料分别连接到单链DNA的两个末端，从而能直接观察到DNA链的作用方式，他们发现这两种染料能相互靠近，然后又分开，这样重复，其中PcrA并没有沿着单链尾部移动，而是与DNA链断裂端结合，拉动DNA使之与结合蛋白分离。当这一过程结束的时候，PcrA就会松开。

这里运用到的单分子荧光技术实际上就是大家熟悉的单分子荧光共振能量转移技术，这种技术是指当两种不同的荧光生色团离的较近，且其中一种生色团（供体, donor）的发射谱与另一种生色团（受体, acceptor）的激发谱有相当程度的重叠时，当供体被激发时，受体会因供体激发能的转移而被激发。其直观表现就是供体产生的荧光强度较其单独存在时要低的多，而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随它们荧光寿命的相应缩短和延长。

这种技术是目前研究蛋白质相互作用比较成熟、已被广泛应用的几种方法之一，而用于DNA与蛋白之间的相互作用关系研究则是近年来动态结构生物学研究领域关注的焦点。

用单分子荧光光谱技术研究生物分子构象变化的方法主要有两种：一是通过单分子荧光偏 振 的 各 向 异 性 （ single molecule fluorescencepolarization anisotropy，smFPA）研究生物分子的构象动力学(conformational dynamics)和旋转运动(rotational motions)。另一个是单分子对荧光共振能量转移(single pair fluorescence resonance energytransfer, spFRET)，在单分子水平测量一个分子内或两个不同分子间的距离变化和相互作用。

在几年前，Taekjip Ha教授研究组就利用这一方法研究分析了DNA解旋酶，他们用荧光染料做上了标记：给Rep（DNA解旋酶中作为引擎的那部分结构）加上了绿色荧光蛋白，给DNA链末端加上了红色荧光蛋白，观测一个荧光分子如何传递能量给另一个从而获知被标记的分子相对于另一个被标记的分子是如何运动的。

研究人员发现当Rep靠近到DNA链末端阻隔时，这个酶并没有停在那儿而是跳回到了DNA链的开端重新开始，如果仍然“读”不过去，Rep就会重复这个过程。这也是Taekjip Ha教授利用FRET成功分析DNA复制过程的一个范例。

单分子FRET是对单个分子的荧光特性进行检测的过程，因为几乎所有的分子生物学实验结果只代表测量时间内大量分子的平均行为 ,而生物体系一般来说都是不均匀体系 ,尤其对于生物大分子而言 。因此监测单个生物大分子的行为具有重要意义。

FRET最基本的原理是通过易于检测的荧光共振能量转移的效率信息来反映两分子团的距离信息，而距离接近到 10 nm之间是两分子相互作用或一个分子的两个结构域因构象改变而相互靠近的有力证据。通过 FRET效率的增强可检测分子间发生相互作用或构象改变而靠近;FRET效率的减弱可用于证明两分子远离因而失去相互作用，或证明一个分子的两个部分间因分子被切断或构象改变而相互远离。

在分子水平上研究任何生物学机制都可以运用FRET技术，关键在于找到合适的荧光探针和检测设备。事实上FRET方法的应用领域非常广泛。近年来在核蛋白机制、细胞外基质、生物膜功能、信号转导等多个方向领域都可以找到FRET技术的应用案例。这一技术无疑已成为细胞分子机制研究的重要工具。