中华人民共和国卫生部(化学品毒性鉴定技术规范)

总则

1 依据

2 范围

3 规范性引用文件

4 术语解释

5 化学品毒性鉴定程序和方法

6 化学品毒性鉴定项目的选择原则

7 受试样品的规定

8 应客观评价动物试验的结果，

9 对化学品毒性鉴定机构的要求

10 对实验动物及动物实验室的要求

11 鉴定报告内容

第一阶段试验

急性吸入毒性试验

Acute Inhalation Toxicity Test

1 范围

2 规范性引用文件

3 试验目的

4 定义

5 试验基本原则

6 试验方法

7 鉴定报告

8 试验结果的解释

急性经皮毒性试验

1 范围

2 规范性引用文件

3 试验目的

4 定义

5 试验基本原则

6 试验方法

7 试验结果评价

8 鉴定报告

9 试验结果的解释

急性经口毒性试验

Acute Oral Toxicity Test

1 范围

2 规范性引用文件

3 试验目的

４ 定义

5 试验基本原则

6 试验方法

7 鉴定报告

8 试验结果的解释

急性眼刺激性/腐蚀性试验

1 范围

2 规范性引用文件

3 试验目的

4 定义

5 试验基本原则

6 试验方法

7 鉴定报告

8 试验结果的解释

中华人民共和国卫生部

关于印发《化学品毒性鉴定技术规范》的通知

卫监督发〔２００５〕２７２号

各省、自治区、直辖市卫生厅局，新疆生产建设兵团卫生局，中国疾病预防控制中心、卫生部卫生监督中心：为了规范化学品毒性鉴定工作，加强对化学品毒性鉴定工作的管理，根据《中华人民共和国职业病防治法》和《危险化学品管理条例》等法律法规的规定，我部组织制订了《化学品毒性鉴定技术规范》。现印发给你们，请遵照执行。本规范自２００５年１０月１日起施行。实施中出现的问题，请及时反馈我部卫生执法监督司。

附件：化学品毒性鉴定技术规范

二○○五年七月十一日

化学品毒性鉴定技术规范

总则

General Principles

1 依据

根据《中华人民共和国职业病防治法》、《作业场所使用有毒物品劳动保护条例》、《危险化学品安全管理条例》、《职业卫生技术服务机构管理办法》、《化学品毒性鉴定管理规范》制定本规范。

2 范围

本规范规定了化学品毒性鉴定的毒理学检测程序、项目和方法，适用于化学品毒性鉴定和评价。

3 规范性引用文件

GB 14924-2001 实验动物与饲料标准

GB 14925-2001 实验动物 环境及设施

OECD Guideline for Testing of Chemicals (1981 ~ 2002)

USA Code of Federal Regulations, Title 40, Volume 28

USEPA OPPTS Health Effects Test Guidelines (1996 ~ 2000)

4 术语解释

化学品（Chemicals）：本规范所称化学品，系指工业用和民用的化学原料、中间体、产品等单分子化合物、聚合物以及不同化学物组成的混合剂与产品。不包括法律、法规已有规定的食品、食品添加剂、化妆品、药品等。

急性吸入毒性（Acute Inhalation Toxicity）：实验动物短时间（24h内）持续吸入一种可吸入性受试样品后，在短期内出现的健康损害效应。

半数致死浓度（Median Lethal Concentration，LC50）：指在一定时间内经呼吸道吸入受试样品后引起受试动物发生死亡概率为50%的浓度。以单位体积空气中受试样品的质量(mg/m)来表示。

急性经皮毒性（Acute Dermal Toxicity）：实验动物短时间（24h内）经皮肤接触受试样品后，在短期内出现的健康损害效应。

急性经口毒性（Acute Oral Toxicity）：一次或在24h内多次经口给予实验动物受试样品后，动物在短期内出现的健康损害效应。

半数致死剂量（Median Lethal Dose，LD50）：在一定时间内经口或经皮给予受试样品后，使受试动物发生死亡概率为50%的剂量。以单位体重接受受试样品的质量(mg/kg bw或g/kg bw)来表示。

皮肤刺激性（Dermal Irritation）：皮肤涂敷受试样品后局部产生的可逆性炎性变化。

皮肤腐蚀性（Dermal Corrosion）：皮肤涂敷受试样品后局部引起的不可逆组织损伤。

眼刺激性（Eye Irritation）：眼球表面接触受试样品后产生的可逆性炎性变化。

眼腐蚀性（Eye Corrosion）：眼球表面接触受试样品后引起的不可逆性组织损伤。

皮肤致敏（过敏性接触性皮炎）(Skin Sensitization，Allergic Contact Dermatitis)：皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应。对于人类这种反应可能以瘙痒、红斑、丘疹、水疱、融合水疱为特征。动物的反应不同，可能只见到皮肤红斑和水肿。

亚急性经口毒性（Subacute Oral Toxicity）：实验动物在14～28天内，每日经口接触受试样品后所引起的健康损害效应。

亚急性经皮毒性（Subacute Dermal Toxicity）：实验动物在14～28天内，每日经皮接触受试样品后所引起的健康损害效应。

亚急性吸入毒性（Subacute Inhalation Toxicity）：实验动物在14～28天内，每日经呼吸道接触受试样品后所引起的健康损害效应。

致突变性（Mutagenicity）：受试样品引起原核或真核细胞、或实验动物遗传物质发生结构和/或数量改变的效应。

免疫毒性（Immunotoxicity）：受试样品引起机体免疫功能抑制或异常增强的效应。

神经毒性（Neurotoxicity）：受试样品对神经系统功能或结构的损害效应。

亚慢性经口毒性（Subchronic Oral Toxicity）：实验动物在其部分生存期（不超过10%寿命期）内，每日经口接触受试样品后所引起的健康损害效应。

亚慢性经皮毒性（Subchronic Dermal Toxicity）：实验动物在其部分生存期（不超过10%寿命期）内，每日经皮接触受试样品后所引起的健康损害效应。

亚慢性吸入毒性（Subchronic Inhalation Toxicity）：实验动物在其部分生存期（不超过10%寿命期）内，每日经呼吸道接触受试样品后所引起的健康损害效应。

蓄积毒性（Cumulative Toxicity）：受试样品在体内蓄积引起的有害效应，蓄积有两种形式：（1）物质蓄积，即长期反复接触受试样品时，由于吸收速度超过消除速度导致的该物质在体内逐渐增多；（2）功能蓄积，即受试样品虽然在体内的代谢和排出速度较快，但其造成的损伤恢复慢，在前一次的损伤未恢复前又发生新的损伤，如此残留损伤的累积称为功能蓄积。

致畸性（Teratogenicity）：受试样品在胚胎发育期引起胎仔永久性结构和功能异常的效应。

生殖毒性（Reproduction Toxicity）：受试样品对亲代繁殖功能或能力的影响和/或对子代生长发育的损害效应。

生长发育毒性（Developmental Toxicity）：妊娠动物接触受试样品而引起的子代在出生以前、围产期和出生以后所显现出的机体缺陷或功能障碍。

无可见有害作用水平（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）：在规定的试验条件下，用现有的技术手段或检测指标未观察到任何与受试样品有关的毒性作用的最大染毒剂量或浓度。

最低可见有害作用水平（Lowest Observed Adverse Effect Level，LOAEL）：在规定的试验条件下，受试样品引起实验动物形态、功能、生长发育等发生有害改变的最低染毒剂量或浓度。

慢性毒性（Chronic Toxicity）：实验动物在其正常生命期的大部分时间内接触受试样品所引起的健康损害效应。

致癌作用（Carcinogenesis）：受试样品引起肿瘤发生率和/或类型增加、潜伏期缩短的效应。

基线剂量（Benchmark Dose, BMD）：由于NOAEL和 LOAEL都是实验中的具体剂量值，易受每组样本含量大小和组间距宽窄等因素影响，故设定基线剂量，可选择ED1（概率为1%的受试个体出现效应的剂量），或选择ED5（概率为5%的受试个体出现效应的剂量）或ED10（概率为10%的受试个体出现效应的剂量）的95%可信限下限。

毒物代谢动力学（Toxicokinetics）：定量研究毒物在体内吸收、分布、生物转化、排泄等过程随时间变化的动态规律的学科。

安全系数（Safety Factor，SF）：在以动物试验数据外推到人，或以小范围人群调查结果判断所评价的化学品对大范围人群的有害作用时，为排除所涉及的不确定因素而设定的系数，用于制定化学品控制标准，以保证接触人群的安全。

危险性参考剂量（Risk Reference Dose，RfD）：危险度达到可接受程度的剂量。

危险性参考浓度（Risk Reference Concentration，RfC）：危险度达到可接受程度的浓度。

日允许摄入量（Acceptable Daily Intake，ADI）：终身每日摄入化学物而不引起可检出的健康损害效应的剂量，一般以mg/kg bw.d表示。

（致癌物的）实际安全剂量（Visual Safe Dose，VSD）：化学品引起致癌率有99%的把握低于10的剂量水平。

职业接触限值（Occupational Exposure Limit，OEL）：是职业性有害因素的接触限制量值，指劳动者在职业活动过程中长期反复接触对机体不引起急性或慢性有害健康影响的容许接触水平。

最高容许浓度（Maximal Allowable Concentration，MAC）：指工作地点、在一个工作日内、任何时间均不应超过的有毒化学物的浓度。

5 化学品毒性鉴定程序和方法

化学品毒性鉴定分为4个阶段

（1）第一阶段（急性毒性试验、眼刺激试验和皮肤刺激试验）

主要是急性毒性参数的测定和了解受试样品对皮肤、粘膜的刺激性以及致敏性，为毒性分级和标签管理提供依据。同时，可了解受试样品对机体造成急性损害的可能性和严重程度，并为第二阶段各项试验的剂量设计提供依据。在测定LD50时，一般要求用两种动物，染毒途径应包括所有人体可能的接触途径。

· 急性吸入毒性试验

· 急性经皮毒性试验

· 急性经口毒性试验

· 急性眼刺激性/腐蚀性试验

· 皮肤刺激性/腐蚀性试验

· 皮肤变态反应试验（皮肤致敏试验）

（2）第二阶段（亚急性毒性试验和致突变试验）

主要是了解受试样品的亚急性毒性和遗传毒性，为第三阶段各项试验剂量设计和观察指标的选择提供依据，并对受试样品的致癌性进行预测。

· 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）

· 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

· 体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验

· 体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验

· 哺乳动物精原细胞/初级精母细胞染色体畸变试验，或

· 精子畸形试验

· 啮齿类动物显性致死试验

· 免疫毒性评价试验方法

· 亚急性吸入（14/28天）毒性试验

· 亚急性经皮（21/28天）毒性试验

· 亚急性经口（28天）毒性试验

（3）第三阶段（亚慢性毒性试验、致畸试验、繁殖试验）

通过亚慢性试验进一步确定多次重复染毒的毒作用性质和靶器官，初步确定NOAEL或LOAEL，为第四阶段各项试验的剂量设计和观察指标的选择提供依据；通过致畸试验判断受试样品的胚胎毒性及其是否有致畸性。通过繁殖试验，可判断受试样品对生殖过程的损害作用。通过迟发性神经毒性试验，可判断受试样品是否具有迟发性神经毒作用。

· 亚慢性吸入毒性试验

· 亚慢性经皮毒性试验

· 亚慢性经口毒性试验

· 致畸试验

· 两代繁殖毒性试验

· 迟发性神经毒性试验

（4）第四阶段（慢性毒性试验和致癌试验）

通过慢性毒性试验可确定受试样品的NOAEL和LOAEL，为推算受试样品的安全接触限值提供依据。通过致癌试验可以确定受试样品对受试实验动物的致癌性。通过代谢动力学试验可以了解受试样品的吸收、分布、代谢和排泄特点，了解蓄积毒性作用及其可能的靶器官和毒作用机理。

· 慢性吸入毒性试验

· 慢性经皮毒性试验

· 慢性经口毒性试验

· 致癌试验或慢性毒性试验合并致癌试验

· 毒物代谢动力学试验

参考方法

· 皮肤变态反应试验-局部淋巴结法

· 大肠杆菌回复突变试验

· 酵母菌基因突变试验

· 体外哺乳动物细胞正向基因突变试验

· 果蝇伴性隐性致死试验

· 枯草杆菌基因重组试验

· 体外哺乳动物细胞程序外DNA合成（UDS）试验

· 体内哺乳动物外周血细胞微核试验

· 体外哺乳动物姊妹染色单体交换（SCE）试验

· 体内哺乳动物骨髓细胞姊妹染色体交换（SCE）试验

· 繁殖/生长发育毒性筛选试验

· 亚急性毒性合并繁殖/发育毒性筛选试验

· 一代繁殖试验

· 神经毒性筛选组合试验

6 化学品毒性鉴定项目的选择原则

6.1试验项目的选择应当根据化学品的理化特性，特别是通过对其化学结构与活性关系进行初步分析，并尽量了解其使用范围、生产或使用过程、人体接触情况和现有文献资料，根据具体情况选择系统的或补充的毒性试验。在化学品毒性鉴定过程中，根据各阶段的试验结果，有针对性地取舍进一步试验的项目和观察指标，以完善对该化学品所做出的毒性鉴定资料的科学性和可靠性。

6.2受试样品的染毒途径应与人体可能接触的途径一致，对人体有可能通过呼吸道、皮肤和消化道三种途径接触的化学品，应进行吸入、经皮和经口三种染毒途径的各项试验；常温下呈气态的化学品一般不进行经口染毒途径的各项试验；20℃蒸气压≤1×10 Pa的非粉末状化学品一般不需进行吸入染毒途径的各项试验。

6.3对有可能与皮肤或眼睛接触的化学品，应进行皮肤或眼刺激性试验；如化学品的pH≤2或≥11，则不必进行皮肤和粘膜的刺激试验，并认为其对皮肤和眼有腐蚀作用。

6.4对有可能与皮肤反复接触的化学品，应进行皮肤致敏试验；经皮毒性属高毒以及对皮肤有腐蚀作用的化学品则不进行皮肤致敏试验。

6.5我国首创或根据国内外文献报道首次生产的化学品，原则上需进行4个阶段的毒理学试验。首先必须做急性毒性试验、亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验、三项致突变试验（包括基因水平和染色体水平的体外、体内试验）、致畸试验和繁殖试验。根据试验结果，判断是否需继续做其它试验项目。

6.6引进国外的生产技术，生产国外已登记生产和批准应用的化学品，如国内的生产单位能证明所生产化学品的理化性质、纯度、主要杂质成分及含量均与国外同类化学品一致时，可先进行第一阶段和两项致突变试验（包括基因水平和染色体水平两种类型的试验）。如试验结果与国外同类化学品一致，可不继续进行第三阶段和第四阶段试验。

6.7与国内已获批准生产的化学品属同类化学品的，如国内的生产单位能证明所生产化学品的理化性质、纯度、主要杂质成分及含量均与国内同类化学品一致时，可先进行急性毒性试验和一项致突变试验。如试验结果与国内同类化学品一致，可不继续进行试验。

6.8凡将两种以上的化学品混配成新的制剂时，除必须按相应要求对其成分分别进行试验外，还应进行急性联合毒性试验，如有明显的协同作用，则根据具体情况对该制剂进行必要的其它毒性试验。

6.9致突变试验的选择原则

6.9.1进行3项致突变试验的化学品，如2项或3项试验结果为阳性，应进行致癌试验。如仅1项试验结果为阳性，应增做另一项同类型的致突变试验，如结果仍为阳性，应进行致癌试验；如结果为阴性，可不继续进行试验。如3项结果均为阴性，可不继续进行试验。

6.9.2进行2项致突变试验的化学品，如2项试验结果为阳性，应进行第三阶段和第四阶段的相应试验。如仅1项试验结果为阳性，应增做另一项同类型的致突变试验。如结果仍为阳性，应进行第三阶段和第四阶段的相应试验；如结果为阴性，可不继续进行试验。如2项结果均为阴性，可不继续进行试验。

6.9.3进行1项致突变试验的化学品，如试验结果为阳性，应增做另一项同类型的致突变试验。如结果仍为阳性，应进行第三阶段和第四阶段的相应试验。如结果为阴性，可不继续进行试验。

7 受试样品的规定

7.1受试样品必须是按照既定的生产工艺和配方进行规范化生产的产品，其成分和浓度与实际生产、经营和使用的产品相同。

7.2提供与受试样品毒性有关的物理、化学性质资料

7.2.1化学名称、CAS编号、结构式

7.2.2测定方法、纯度、所含主要杂质、光谱图

7.2.3性状、气味、稳定性（热、空气、光）

7.2.4密度、熔点（℃）、沸点（℃）、闪点、蒸气压（Pa ℃）、表面张力（N/M ℃）、水中溶解度（mg/L ℃）、脂溶性（mg/100g ℃，说明溶剂种类）、脂水分配系数（说明溶剂种类）、膨胀系数、爆炸极限、pH值、一定pH值下的水解情况

7.3提供原料来源、生产工艺、人的可能摄入量、使用说明书等有关资料

7.4对受试样品的处理

7.4.1受试样品应新鲜配制。除非有资料表明以溶液（或乳浊液、悬浊液等）保存具有稳定性。固体受试样品应溶于或悬于适当的赋形剂（溶剂或载体）中，并进行稀释。液体受试样品可直接使用或稀释后使用。根据受试样品的理化性质（水溶性和/或脂溶性）确定受试样品所用的赋形剂。所用赋形剂在使用剂量水平对实验动物、菌株或细胞应不产生毒作用，且不与受试样品发生任何化学反应，并能保持受试样品的稳定性。通常用蒸馏水、等渗盐水、植物油、食用淀粉、羧甲基纤维素等。如不是常用赋形剂，应有参考资料说明其成份。

7.4.2对膨胀系数较高的化学品应考虑膨胀系数对试验结果的影响，急性经口毒性试验中的最高剂量应为实验动物能够耐受的最大染毒剂量，并根据试验结果确定其它试验的剂量设计，如最大染毒剂量未观察到明显毒性效应，则体内致突变试验、亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验的最高剂量均应达到实验动物能够耐受的最大染毒剂量。

7.4.3如果将受试样品掺入饲料或溶于饮水中进行染毒，受试样品在饲料或饮水中的含量应恒定并进行稳定性监测。受试样品的添加量不能破坏饲料中的营养平衡。实验动物应单笼饲养，必须用减重法称量每周的食物摄入量（如果受试样品是加入饮水中染毒的，也应测量水的摄入量），并通过食物或饮水的消耗情况计算动物对受试样品的摄入量。

8 应客观评价动物试验的结果，

将其外推到人的意义是有限的。尽可能结合人群观察资料，作出科学的综合性评价。

8.1在使用NOAEL或LOAEL等对化学品的安全性进行评价时，可根据情况调整安全系数（例如对于在试验或流行病学调查中发现有致癌或致畸作用的化学品，安全系数可增大至100～1000。在制定工作场所空气中化学品职业接触限值（OEL）时，应更注重流行病学调查资料，参考动物试验数据，一般以动物试验的NOAEL或LOAEL为基准，安全系数可以小于20。

可按下列公式计算得出各种卫生限值。

式中SF1×SF2×SF3……×SFn 代表从各个角度考虑的安全系数，在计算ADI时一般以100作为安全系数（SF=10(种属差异)×10(个体差异)）。

8.2在应用致突变试验结果筛选致癌物时，应用下列计算式计算致突变性阳性结果预期致癌性的概率：

式1：

式1适用于对同一种致突变试验结果的推算，式中M和M为致突变试验结果的阳性数和阴性数；C和C为致癌性的有和无。

式2：

式2适用于对多种致突变试验结果的推算，要求各致突变试验是互相独立的，一般认为反映不同遗传学终点的试验基本相互独立，如多个试验的检测终点为同一遗传学终点，只能将其中一个试验的结果纳入推算，如检测终点相同的试验方法的结果既有阳性又有阴性，则将呈阳性的试验方法的结果纳入推算。设阳性结果有K个，相应的灵敏度为a1，a2…aK(a=1-P(M/C))，相应的特异度为a1,a2…aK(a=1-P(M/C))，同时设阴性结果有N个，相应的灵敏度为d1，d2…dK(d=1-P(M/C))，相应的特异度为d1,d2…dK (d=1-P（M/C）)

式中PK（M/C）= a1×a2…×aK

PK（M/C）= （1-a1）×（1-a2）…×（1-aK）

PN（M/C）= d1×d2…×dK

PN（M/C）= （1-d1）×（1-d2）…×（1-dK）

当估算结果P（C/M）≥0.5时应考虑进行动物致癌试验，概率越高，进行动物致癌试验的必要性越大。当P（C/M）≤0.03时，如没有理由认为该化学品属于非遗传致癌物，可暂不考虑进行动物致癌试验。

8.3在对化学品的致畸性进行评价时，我国常用致畸指数（雌鼠LD50/最小致畸剂量）和致畸危害指数（最大不致畸剂量/最大可能摄入量），并按照计算结果进行分级，但由于不同化学品的急性致死剂量-反应关系曲线的情况不一，所以，可换用LD1、LD5或以雌鼠体重降低（与对照组相比降低一定的百分比）的剂量，目前推荐以BMD和安全系数对化学品的致畸性进行评价。

8.4由于诱癌作用无阈值，因此，在对化学品的致癌危险度进行评定时采用实际安全剂量，即化学品引起致癌率有99%的把握低于10的剂量水平。

9 对化学品毒性鉴定机构的要求

从事化学品毒性鉴定的机构应符合《化学品毒性鉴定管理规范》中“化学品毒性鉴定实验室条件及工作准则（GLP）”的各项要求，并根据获得资质的等级从事相应项目的化学品毒性鉴定工作。

10 对实验动物及动物实验室的要求

10.1对实验动物的要求

10.1.1实验动物的基本选择原则

10.1.1.1必须使用具有合格证的实验动物（尚未实行等级管理的动物种属除外）。

10.1.1.2应尽量选用各项试验的首选动物，如选择其他种属应说明原因并确定该种属对所检测的毒性作用敏感。

10.1.2动物试验的一般要求（某些试验对实验动物有特殊要求，则以试验方法中所列的要求为准）：

10.1.2.1用于同一项试验的同性别动物，在进行试验前个体之间的体重相差最多不超过20%。

10.1.2.2雌性动物一般应为未交配过的。

10.1.2.3实验动物在实验环境中需适应至少3～5天后才能开始染毒。

10.1.2.4在同一次试验中需多次进行经口染毒时，至少每周对受试动物进行称重并根据体重调整每只动物的染毒体积。

10.1.3动物福利要求

应尽量减少实验动物的使用量，同时为实验动物提供足够的空间，以供动物采取正常的适应姿势，并且能够有适当的移动自由；应提供足够的合格饲料和饮水；在试验过程中应尽量减轻动物的痛苦，不得虐待动物。

10.2进行各项动物试验的动物实验室应符合国家法律法规的有关规定并获得主管部门颁发的合格证。

10.3用于动物试验的饲料、饮水、垫料、笼具等应符合国家法律法规的有关规定（饲料应具有主管部门颁发的合格证）。

10.4 实验动物管理及从事动物试验的人员，必须经培训、考核，持证上岗。

11 鉴定报告内容

11.1受试样品名称、理化性状、配制方法、所用浓度、经口染毒需注明染毒体积。

11.2体内试验需注明：实验动物的种属、品系和来源（注明合格证号和动物级别）、性别、体重范围（周龄）、单笼喂养还是群饲；实验动物饲养环境，包括饲料来源（如非标准饲料，应注明饲料的配方）、室温、相对湿度，动物实验室和饲料的合格证号；剂量设计和动物分组方法，每组所用动物性别、数量及初始体重范围。

11.3体外试验需注明：使用的菌株或细胞种类、使用的培养基、培养浓度、培养温度、培养时间、代谢活化系统；剂量水平、对照组设置、阳性物种类和剂量。

11.4主要操作步骤（如为吸入染毒应注明染毒设备中的气流速度等参数）。

11.5各项检测指标的测定方法及主要检测仪器的名称和型号。

11.6检测结果数据统计学处理方法以及各项参数的计算方法。

11.7体内试验需描述染毒后动物中毒表现及出现时间和恢复情况、死亡时间、大体解剖和尸检所见，进行病理组织学检查的需描述观察结果。

11.8列表报告各项指标测定结果（一般以 的形式表达），并列出经计算所得的毒理学参数。

11.9结论。

第一阶段试验

急性吸入毒性试验

Acute Inhalation Toxicity Test

1 范围

本方法规定了动物急性吸入毒性试验的基本原则、技术和要求。

本方法适用于评价气体、挥发性物质或气溶胶/颗粒物等化学品的急性吸入毒性作用。

2 规范性引用文件

OECD Guideline for Testing of Chemicals ( No.403. Feb. 1981)

OECD Guideline for Testing of Chemicals ( No.433. Feb. 2002)

3 试验目的

3.1 检测化学品对实验动物的急性吸入毒性作用和强度。

3.2 为亚急(慢)性等吸入毒性试验提供剂量选择的依据。

4 定义

4.1 急性吸入毒性(Acute Inhalation Toxicity): 实验动物短时间（24h内）持续吸入一种可吸入性受试样品后，在短期内出现的健康损害效应。

4.2 半数致死浓度（Median Lethal Concentration,LC50）: 指在一定时间内经呼吸道吸入受试样品后引起受试动物发生死亡的概率为50%的浓度。以单位体积空气中受试样品的质量(mg/m)来表示。

4.3 剂量-反应关系(Dose-response Relationship)：表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率之间的关系。

5 试验基本原则

各试验组动物在一定时间内吸入不同浓度的受试样品，染毒浓度的选择可通过预试验确定。染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况。试验期间死亡的动物要进行尸检，试验结束时仍存活的动物要处死并进行大体解剖。

6 试验方法

6.1 实验动物

首选健康成年小鼠(18g～22g)和大鼠(180g～220g)，也可选用其它敏感动物。同性别各剂量组个体间体重相差不得超过平均体重的20%。试验前动物要在试验环境中至少适应 3～5d时间。

6.2 剂量设计

根据所选方法的要求，原则上应设4～5个剂量组，每组动物一般为10只，雌雄各半。各剂量组间距大小以兼顾产生毒性大小和死亡为宜，通常以较大组距和较少量动物进行预试。如果受试样品毒性很低，也可采用一次限量法，即用20只动物（雌雄各半），10000 mg/m吸入2h或 5000 mg/m吸入4h，如未引起动物死亡，则不再进行多个剂量的急性吸入毒性试验。

6.3 染毒

染毒可采用静式染毒法或动式染毒法。

6.3.1 静式染毒法

静式染毒是将实验动物放在一定体积的密闭容器（染毒柜）内，加入一定量的受试样品，并使其挥发，造成试验需要的受试样品浓度的空气，一次吸入性染毒2h。

6.3.1.1 染毒柜的容积以每只染毒小鼠每小时不少于3L空气计，每只大鼠每小时不少于30L计。

6.3.1.2 染毒浓度的计算：染毒浓度一般应采用实际测定浓度。在染毒期间一般可测4～5次，求其平均浓度。在无适当测试方法时。可用下式计算染毒浓度

C=(a×d/v) ×10

式中：

C-- 染毒浓度(mg/m)

a-- 加入受试样品的量(ml)

d-- 化学品密度

v-- 染毒柜容积(L)

6.3.2 动式染毒法

动式染毒是采用机械通风装置，连续不断地将含有一定浓度受试样品的空气均匀不断地送入染毒柜，空气交换量大约为12～15次/h，并排出等量的染毒气体，维持相对稳定的染毒浓度（对通过染毒柜的流动气体应不间断地进行监测，并至少记录 2 次）。一次吸入性染毒2h。当受试化合物需要特殊要求时，应用其它的气流速率。染毒时，染毒柜内应确保至少有19%的氧含量和均衡分配的染毒气体。一般情况下，为确保染毒柜内空气稳定，实验动物的体积不应超过染毒柜体积的5%。且染毒柜内应维持微弱的负压，以防受试样品泄露污染周围环境。同时，应注意防止受试样品爆炸。

6.3.2.1 受试样品气化（雾化）和输入的常用方法

6.3.2.1.1 气体受试样品，经流量计与空气混合成一定浓度后，直接输人染毒柜。

6.3.2.1.2 易挥发液体受试样品，通过空气鼓泡或适当加热促使挥发后输人染毒柜。

6.3.2.1.3 若受试样品现场使用时采取喷雾法时，可采用喷雾器或超声雾化器使其雾化后输入染毒柜。

6.3.2.2 染毒浓度计算

染毒浓度一般应采用动物呼吸带实际测定浓度，每半小时一次，取其平均值。各测定浓度值应在其平均值的25%以内。若无适当的测试方法，也可采用以下公式计算染毒浓度：

C=[a×d/(v1+v2)] ×10

式中：

C-- 染毒浓度(mg/m)

a-- 气化或雾化受试样品的量(ml)

d-- 受试样品密度

v1-- 输入染毒柜风量(L)

v2-- 染毒柜容积(L)

6.4 观察期限及指标

6.4.1 观察并记录染毒过程和观察期内的动物中毒和死亡情况。观察期限一般为14d，观察指标见附录1-A，LC50的计算见附录1-B。

6.4.2 对死亡动物进行尸检。观察期结束后，处死存活动物并进行大体解剖，如有必要，进行病理组织学检查。

6.5 试验结果评价

评价试验结果时，应将LC50与观察到的毒性效应和尸检所见相结合考虑，LC50值是受试样品急性毒性分级和标签标识以及判定受试样品经呼吸道吸入后引起动物死亡可能性大小的依据。引用LC50值时一定要注明所用实验动物的种属、性别、染毒方式及时间长短、观察期限等。评价应包括动物接触受试样品与动物异常表现（包括行为和临床改变、大体损伤、体重变化、致死效应及其它毒性作用）的发生率和严重程度之间的关系。急性吸入毒性分级见附录1-C。

7 鉴定报告

鉴定报告应包括如下内容：

7.1 受试样品名称、理化性状、配制方法、所用浓度；

7.2 动式染毒设备中的气流速度；

7.3 实验动物的种属、品系和来源（注明合格证号和动物级别）;

7.4 实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、动物实验室合格证号；

7.5 所用染毒浓度和动物分组，每组所用动物性别、数量及体重范围；

7.6 计算LC50的方法；

7.7 染毒后动物中毒表现及出现时间和恢复情况、死亡时间、大体解剖所见；

7.8 列表报告结果（建议的表格形式见附录1-D），计算的LC50及其95%可信区间；

7.9 结论。

8 试验结果的解释

通过LC50的测定，可评价受试样品的急性吸入毒性及其毒性分级(见附录1-C),但其结果外推到人类的有效性是有限的。

急性经皮毒性试验

Acute Dermal Toxicity Test

1 范围

本方法规定了动物急性经皮毒性试验的基本原则、技术和要求。

本方法适用于评价化学品的急性经皮毒性。

2 规范性引用文件

OECD GUIDELINE FOR TESTING CHENICALS（No.402.1995）

USEPA OPPTIS Health Effects (Series 870.1200 June 1996)

3 试验目的

确定受试样品能否经皮肤吸收和短期经皮染毒所产生的毒性作用和强度，并为确定亚急（慢）性经皮毒性及其它试验的剂量设计提供试验依据。

4 定义

4.1 急性经皮毒性(Acute Dermal Toxicity):受试样品一次或在24 h 内多次经皮肤染毒所产生的健康损害效应。

4.2 经皮半数致死剂量（Dermal Median Lethal Dose）:一次或在24 h 内多次经皮肤染毒受试样品引起50%实验动物死亡的剂量，以mg/kg bw表示。

4.3 剂量-反应关系(Dose-response Relationship)：表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率之间的关系。

5 试验基本原则

在试验前，先去除实验动物受试部位的被毛。将实验动物分成若干剂量组，每组涂布不同剂量的受试样品，而后观察实验动物中毒反应和死亡情况，计算LD50。对试验中死亡的动物做大体解剖和病理学检查，对试验结束时的存活动物也应做大体解剖。注意排除受试样品引起的皮肤局部刺激或腐蚀作用所致的全身效应。

6 试验方法

6.1 受试样品配制

固体受试样品应研磨，过100目筛。用适量无毒无刺激性赋形剂混匀，以保证受试样品与皮肤良好的接触。常用的赋形剂有水、植物油、凡士林、羊毛脂等。液体受试样品一般不必稀释，可直接用原液试验。

6.2 实验动物

首选大鼠，也可选用豚鼠或家兔。实验动物体重要求范围分别为：大鼠200～300g，豚鼠350～450g，家兔2000～3000g。

试验期间，为避免实验动物相互抓挠，应采用单笼喂养。

试验前24h，在动物背部正中线两侧剪毛或剃毛，仔细检查皮肤，要求完整无损，以免改变皮肤的通透性。去毛面积不应少于实验动物体表面积的10%。各类动物体表面积的数值和计算方法见附录1-E。

6.3 剂量和分组

实验动物随机分为4～5个剂量组。若使用水、植物油、凡士林、羊毛脂外的赋形剂，则需设赋形剂对照组。豚鼠或大鼠每一剂量组（单性别）不少于5只；家兔每一剂量组（单性别）不少于4只。

各剂量组间要有适当的组距，可按等比或等差级设置剂量，以使各剂量组实验动物产生的毒性反应和死亡率呈现剂量-反应（效应）关系。

一般情况下，如果剂量达到2000mg/kg bw仍不出现实验动物死亡时，则不需要再进行高剂量试验。

6.4 试验步骤

选择适当方法固定好实验动物，将受试样品均匀涂布于实验动物的去毛区，并用油纸和两层纱布覆盖，再用无刺激性胶布或绷带加以固定，以保证受试样品和皮肤的密切接触，防止脱落和动物舔食受试样品。涂布4h后取下固定物和覆盖物，用温水或适当的溶剂洗去皮肤上残留的受试样品。

6.5 观察期限及指标

观察并记录染毒过程和观察期内的动物的中毒和死亡情况。观察期限一般为14d，全面观察中毒的发生、发展过程和规律以及中毒特点和毒作用的靶器官，观察指标见附录1-A，LD50的计算见附录1-B。

对死亡动物进行尸检。观察期结束后，处死存活动物并进行大体解剖，如有必要，进行病理组织学检查。

7 试验结果评价

按附录1-B计算LD50，按附录1-C进行急性经皮毒性分级。

8 鉴定报告

鉴定报告应包括以下内容：

8.1 实验动物种属品系、来源、饲养环境、饲料和饮水；

8.2 按剂量组列表(见附表1-D)说明每组动物数、性别状况、出现毒效应的动物数、死亡动物数；

8.3 染毒时间、染毒持续时间、染毒后动物中毒的主要表现；

8.4 LD50计算方法；

8.5 LD50值及其95%可信区间（包括雌、雄实验动物各自的LD50）；

8.6 病理组织学检查结果；

8.7 结论。

9 试验结果的解释

经皮LD50是评价化学物急性毒性的重要参数之一，也是急性毒性分级的依据。但LD50仅表示受试样品经皮吸收引起实验动物死亡50%的剂量，并不能全面反映受试样品经皮吸收的所有急性毒性特征，因此，评价一受试样品经皮急性毒性既要考虑其对某一品系实验动物的经皮LD50值，又要考虑其中毒症状表现及反应出现的早晚和持续时间的长短，并结合体重变化与病理学检查结果等，经综合分析才能得出经皮急性毒性较为全面的评价。

急性经口毒性试验

Acute Oral Toxicity Test

1 范围

本方法规定了动物急性经口毒性试验的基本原则、技术和要求。

本方法适用于评价化学品的急性毒性作用。

2 规范性引用文件

OECD Guideline for Testing of Chemicals (No. 401. Feb. 1987 )

OECD Guideline for Testing of Chemicals (No. 425. Feb. 2001 )

USEPA OPPTIS Health Effects Guideline (Series 870.1100 June 1996)

3 试验目的

3.1 检测化学品对实验动物的急性毒性作用和强度。

3.2 为亚急(慢)性等毒性试验提供剂量选择的依据。

3.3 试验结果可作为化学品急性毒性分级和标签标识。

４ 定义

4.1 急性经口毒性(Acute Oral Toxicity): 一次或在24h内多次经口给予实验动物受试样品后，动物在短期内出现的健康损害效应。

4.2 经口半数致死剂量（Oral Median Lethal Dose）: 经口一次或24h内多次经口给予受试样品后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量。以单位体重接受受试样品的质量(mg/kg bw或g/kg bw)来表示。

4.3 剂量-反应关系(Dose-response Relationship)：表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率之间的关系。

5 试验基本原则

以经口灌胃法给予各试验组动物不同剂量的受试样品，每组用一个剂量，染毒剂量的选择可通过预试验确定。染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况。试验期间死亡的动物要进行尸检，试验结束时仍存活的动物要处死并进行大体解剖。本方法主要适用于啮齿类动物的研究，但也可用于非啮齿类动物的研究。

6 试验方法

6.1 受试样品的处理

受试样品应溶解或悬浮于适宜的赋形剂中，（不溶性固体或颗粒状物质研磨、过100目筛）建议首选水或食用植物油（如玉米油）作溶剂，也可考虑使用其它赋形剂（如羧甲基纤维素、明胶、淀粉等）等配成混悬液；不能配制成混悬液时，可配制成其它形式(如糊状物等)，但不能采用具有明显毒性的有机化学溶剂。如采用有毒性的溶剂应单设溶剂对照组观察。

6.2 实验动物

首选健康成年小鼠(18g～22g)和大鼠(180g～220g)，也可选用其它敏感动物。同性别实验动物个体间体重相差不得超过平均体重的20%。试验前动物要在试验环境中至少适应3～5d时间。

6.3 剂量设计

根据所选方法的要求，原则上应设4～5个剂量组，每组动物一般为10只，雌雄各半。各剂量组间距大小以兼顾产生毒性大小和死亡为宜，通常以较大组距和较少量动物进行预试。如果受试样品毒性很低，也可采用最大限量法，即用20只动物（雌雄各半），采用5000mg/kg bw剂量，如未引起动物死亡，可不再进行多个剂量的急性经口毒性试验。

6.4 试验步骤

6.4.1 试验前实验动物应禁食（一般16h左右），不限制饮水。若采用代谢率高的其它动物，禁食时间可以适当缩短。

6.4.2 正式试验时，称量动物体重，随机分组，然后对各组动物用经口灌胃法一次染毒。各剂量组的灌胃体积应相同, 小鼠常用容量为20ml/kg bw，大鼠常用容量为10ml/kg bw。若一次给予容量太大，也可在24ｈ内分2～3次染毒（每次间隔4h～6h），但合并作为一次剂量计算。染毒后继续禁食3h～4h。若采用分批多次染毒，根据染毒间隔长短，必要时可给动物一定量的食物和水。

6.4.3 观察期限及指标

观察并记录染毒过程和观察期内的动物的中毒和死亡情况。观察期限一般为14d，观察指标、LD50的计算及试验记录形式分别见附录1-A、1-B、1-D。

对死亡动物进行尸检。观察期结束后，处死存活动物并进行大体解剖，如有必要，进行病理组织学检查。

6.5 可采用多种方法测定LD50，建议采用霍恩氏法、寇氏法、概率单位-对数图解法、最大耐受量试验和上-下法等(见附录1-B)。

7 鉴定报告

鉴定报告应包括如下内容：

7.1 受试样品名称、理化性状、配制方法、所用浓度；

7.2 实验动物的种属、品系和来源（注明合格证号和动物级别）;

7.3 实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、动物实验室合格证号；

7.4 所用剂量和动物分组，每组所用动物性别、数量及体重范围；

7.5 染毒后动物中毒表现和死亡情况及出现时间，大体解剖及病理所见；

7.6 计算LD50的方法及其LD50和95%可信限；

7.7 列表报告结果（建议的表格形式见附录D）；

7.8 结论。

8 试验结果的解释

通过急性经口毒性试验和LD50的测定可评价受试样品的急性经口毒性、急性经口毒性分级，其结果外推到人类的有效性很有限。

急性眼刺激性/腐蚀性试验

Acute Eye Irritation/Corrosion Test

1 范围

本规范规定了动物急性眼刺激/腐蚀性试验的基本原则、要求和方法

本规范适用于检测化学物的眼睛刺激性/腐蚀性。

2 规范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No 405，Feb.1987)

USEPA OPPTS Health Effects Test Guidelines (Series 870.2400, Aug.1998)

3 试验目的

确定评价化学物对哺乳动物眼睛是否有刺激作用/腐蚀作用及其程度。

4 定义

4.1 眼睛刺激性(Eye Irritation)：指眼球表面接触受试样品后产生的可逆性炎性变化。

4.2 眼睛腐蚀性(Eye Corrosion)：指眼球表面接触受试样品后引起的不可逆性组织损伤。

5 试验基本原则

5.1 受试样品以一次剂量滴入每只实验动物的一侧眼睛结膜囊内，以未作处理的另一侧眼睛作为自身对照；

5.2 在规定的时间间隔内，观察对动物眼睛的刺激和腐蚀作用程度并评分，以此评价受试样品对眼睛的刺激作用。观察时间应能足以评价刺激效应的可逆性和不可逆性。观察时间最少72h，但一般不超过21d；

5.3 当动物出现严重和持久的痛苦迹象时，以适当的方式将动物处死；

5.4 强酸或强碱物质如pH≤2或pH≥11.5，由于其可预见的腐蚀特性，不必做本试验；

5.5 已在皮肤试验中证实具有腐蚀或严重刺激毒性的物质不必进行眼刺激试验，可以推测该物质对眼睛将会引起相似的严重结果；

5.6 在充分并公认的体外试验结果中确定可能产生刺激性或腐蚀性的物质不必进行体内试验。

6 试验方法

6.1 受试样品：液体、固体或半固体、颗粒物。

6.2 实验动物和饲养环境

6.2.1 动物种属

首选健康成年白色家兔，体重2～3kg。如果使用其它的哺乳动物做试验，试验者应提供选择的依据。

6.2.2 动物数量

如果受试样品的显著效应是可预见的，可以考虑用一只动物。如果用一只动物试验得出的结果提示受试样品有严重的刺激性和腐蚀性，则不必进行进一步的试验。如果结果相反，则至少需要3只家兔。有时，在增加动物的进一步试验中应该适当的阐明可疑反应。

6.2.3 饲养环境

动物实验室应符合国家相应规定。常规饲料喂养，自由饮水。

6.3 剂量设计

对于液态受试样品，一般不需稀释，可直接使用原液，染毒量为0.1ml。若受试样品为固态或颗粒状，应将其研磨成细粉状，过200目筛，染毒量应为100mg。

气溶胶产品需喷至容器中，收集其液体再使用。对挥发性物质，剂量可以通过使用前后称量容器质量进行估计。

6.4 试验步骤

6.4.1 试验前眼睛的检查

试验前动物要在动物实验室环境中至少适应3d时间。试验前24h，要对实验动物的两只眼睛进行常规检查。有眼睛刺激症状、角膜缺陷或结膜损伤的动物不能用于试验。

6.4.2 染毒

6.4.2.1 轻轻拉开实验动物一侧眼睛的下眼睑，将受试样品0.1ml(100mg)滴入(或放入)结膜囊中，使上、下眼帘被动闭合1s，以防止受试样品丢失。未处理的另一侧眼睛作为自身对照。

6.4.2.2 滴入受试样品24h内不冲洗眼睛，如果认为必要，在24h时可进行冲洗。

6.4.2.3 如果受试样品有明显的刺激征象，另选3只动物进行冲洗试验。在滴入受试样品30s后，用生理盐水冲洗5min，水的流量和流速都不应导致眼损伤。

6.4.3 观察周期

观察时间最少要72h，也不能严格固定不变，但必须足够以充分评估观察到的可逆或不可逆效应。通常观察时间一般不超过21d。

6.4.4 临床检查和评分

6.4.4.1 在滴入受试样品后的第1h，24h，48h,72h和96h对眼睛进行检查，如果72h时未出现刺激反应，可终止试验。如果发现累及角膜或有其它眼刺激作用，7d内不恢复者，为确定该损害的可逆性或不可逆性需延长观察时间，一般不超过21d。除了对角膜、虹膜、结膜进行观察外，其它损害效应都应记录并报告。在24h观察和记录结束后，可使用荧光素钠对所有动物的眼睛作进一步检查。在每次检查中均应按表1记录眼的刺激反应，并按表2进行眼刺激强度评价。

6.4.4.2 在进行检查时，可使用放大镜、手持裂隙灯，并按表3记录

*实验条件：不冲洗/30秒后冲洗

6.5.2 结果的评价

眼刺激评分应与观察到的反应的性质和可逆性或其它方面结合进行评价。单独的积分值不能作为受试样品的刺激性质的最后评判，应将所有观察结果及各种因素进行综合评价。

7 鉴定报告

除一般鉴定报告的内容外，还应包括以下方面：

7.1 表格记录每只动物每个时间点（如1h, 24h, 48h，72h和4d,7d）的刺激反应；

7.2 具体描述除眼部以外的其它作用；

7.3 刺激／腐蚀程度和性质的描述；

7.4 描述在各观察时点积分时的检查方法（如裂隙灯、生物显微镜、荧光素染色）；

7.5 结论。

8 试验结果的解释

急性眼刺激试验结果从动物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多数情况下对有刺激性或腐蚀性的物质较人类敏感。若用其它品系动物进行试验时也得到类似结果，则会增加从动物外推到人的可靠性。