| 词条 | 光转换荧光蛋白 |
| 释义 | 发现荧光蛋白并利用基因工程对这些蛋白进行重组和优化后，扩展了生物学家的研究手段，他们可以在更广泛的空间和时间分辨率内对活细胞进行观察，并可以进行细胞内分子追踪、分子定量等研究，从而可以分析活细胞中蛋白质分布、运动、衍生物情况和生物化学特性。蛋白质功能研究已经被公认为继测定基因组序列之后最重要的细胞活动研究重点。 光活化荧光蛋白PA-GFP第一个被设计用于光活化研究的光学指示剂是一种Aequorea victoria水母的蛋白突变体，叫做PA-GFP（分别取photo和activatable的首字母）。这种GFP蛋白的光活化突变体是将野生型中性蛋白质改造为阴离子态得来的。在稳定状态（unperturbed state）时，野生型绿色荧光蛋白在395和475nm处分别有一大一小两个吸收峰。当用强紫外或紫光照射该蛋白时，发色团产生光转化，从而改变了大小两个吸收峰的相对消光系数的比值。结果是在488nm激发下，发射荧光的强度比未刺激前增加了3倍。 由上至下分别为FRAP、FLIP、光活化。 通过突变技术的PA-GFP降低了475nm处的吸收峰，在450~550nm处的吸收几乎可以忽略不计，同时增强近紫外（约400nm）照射下野生型光转化效率。因此极大增加了非活化和活化状态之间的反差。光活化后，PA-GFP在504nm处的最大吸收增加了约100倍。这一现象极大增强了转化和未转化PA-GFP之间的差异，以此可以最终观察其在细胞内的动态变化（见图2）。 三种典型光诱导蛋白显示了光活化前后的PA-GFP吸收和发射峰曲线。图中标明了用于光转化的激光波长（箭头所示）和宽场弧光灯激发波段（黄色框）。图3a中的活化后荧光发射曲线是在488nm激光激发下得到的。用405nm固体激光器可以激发目的位点，如图3b所示。光活化后，绿色发射荧光的强度会明显上升，如图3c所示。 PA-GFP谱线和光活化特性PA-GFP的光活化可以用来标记选定分子或整个细胞，并利用延时图像技术获取动力学特征。在理想状态下，只有活化的PA-GFP分子发射醒目的荧光，新合成的蛋白不会对实验造成影响。PA-GFP的光活化会比利用GFP进行光漂白研究的速度更快、现象更明显，而且用于光活化的激光强度要远小于FRAP的漂白激光，对细胞的杀伤相对较低。因此该项技术非常适合活细胞中蛋白质的动态研究。 但需要注意的是在光转化后，PA-GFP和野生型GFP荧光在488nm激发下都会表现同样水平的增强。但从另一方面讲，在未被光诱导（如405nm激发）前很难区分细胞是否表达PA-GFP，所以用显微镜很难提前确定确切的表达区域。 可擦写光学蛋白Dronpa从Pectiniidae（一种石化珊瑚虫）中提取的单体荧光蛋白Dronpa 预示了新一代的可开关特殊荧光蛋白的诞生。Dronpa表现出了与众不同的光变色性能，它可以用两种不同的激发光控制荧光的开和关。 Dronpa荧光蛋白惊人的特点是可以在488nm下快速漂白，并且随后又可以在405nm激发光刺激下完全恢复。这种模式的光漂白和活化可以反复进行。 显示了转基因细胞中Dronpa蛋白在光漂白和光活化之间的可逆转换。该细胞被转染了只含有Dronpa蛋白基因（没有其他融合基因）的质粒并在细胞培养瓶中培养。最初在488nm下标本显示很明亮的绿色荧光（图4，0s），50~60s后亮度逐渐衰减（图4，0~55s）至检测不到。荧光衰减曲线如图4a中绿色曲线所示。用405nm近紫外激光活化后，Dronpa蛋白的荧光强度恢复（图4，紫色曲线）。同样方法反复光漂白和活化重复10次以上的图形（图4b）显示，多次反复后Dronpa荧光的恢复会有一定的衰减。10次循环后，Dronpa 荧光减少为原来的88%左右。 Dranpa蛋白的光学特点光诱导变色荧光蛋白KEADE 目前已经从珊瑚虫和海葵中提取和开发出了许多有应用潜力的光学指示剂。其中一个非常重要的是Kaede蛋白，受紫外激发后这种蛋白会产生从绿色到红色的光转化。光转化后，红/绿比会显著增加约2000倍（红增、绿减）。这一类具有独特颜色转换特性的光学指示剂会成为亚细胞器乃至整个细胞光学标记的最佳选择。 显示的是光转化前后Kaede 蛋白的吸收、发射光谱曲线和细胞中两种颜色荧光融合的动态图像。分别用绿色的虚/实线代表转化前Kaede蛋白的吸收/发射曲线，用红色虚/实线代表转化后Kaede蛋白的吸收和发射曲线。由图可以看出，经过光诱导后红和绿两个荧光发射峰之间的差异非常明显，发射峰值距离约为60nm。图5a到图5d数码图像为我们展示了光转化前Kaede的绿色荧光，见图5a，用405nm激光对选择区域进行短时间激发，如图5b中红色部分所示，转化后Kaede蛋白逐渐扩散到整个细胞但没有进入细胞核的动态图像，见图5c和图5d。 Keade蛋白的光谱特征和光转化特点。 利用Keade蛋白在光转化前后的明显颜色变化，研究者可以持续追踪红色荧光的动态变化，进而描述出其标记的动力学特征。利用这种显著的颜色差异，这种蛋白还更多的被用于区分特异细胞和周围类似细胞的实验中。 实验操作要求在光转化和光活化实验中，选择感兴趣区域进行刺激的比较理想的操作方法是使用声光调制器（acousto-optic tunable filter，AOTF），用它可以非常方便地定义光的波长通过范围对标本进行光刺激。 但使用共聚焦和AOTF方法研究光转化或光活化反应存在重要缺陷：刺激和取图要共用同一对XY扫描振镜，所以刺激和扫描只能分开在不同时间段进行。这样操作存在几个弊端： 第一，刺激的同时无法观察细胞反应； 第二，无法确定细胞确切的受诱导状态，经常需要在刺激和取图之间反复切换，以获取最佳的诱导状态； 第三，由于在AOTF/ZOOM诱导和常规取图之间切换有明显的时间延迟，所以该方法对快速反应无能为力； 第四，刺激激光和取图激光都使用XY振镜，并且使用同样光路，所以刺激速度和效率都受到限制。Kaede经特定波长的光（其光谱为从紫外线到紫色光）照射时发生荧光光谱转换，从绿色变为红色（不可逆转） |
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