| 词条 | GFP |
| 释义 | GFP,即绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein ) 2001年1月11日，美国科学家宣布培育成世界上首只转基因猴, 这是世界上首次培育成功转基因灵长类动物. 添加在这只名为"安迪"的猴子体内的就是这种标志基因。 GFP:绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。这类学名为Aequorea victoria的水母有着美丽的外表,生存历史超过1.6亿年。1962年,下村修正是在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。 发光机理当蛋白质链折叠时,这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段,得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。但此时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形式。上述绿色荧光蛋白发色团的形成过程,系由几位科学家分别研究完成的。绿色荧光蛋白不仅无毒,而且不需要借助其他辅酶,自身就能发光,可以让科学家在分子水平上研究活细胞的动态过程。当绿色荧光蛋白的基因和我们感兴趣的有机体内所拟研究的蛋白质基因相融合时,蛋白质既能保持其原有的活性,绿色荧光蛋白的发光能力也不受影响。通过显微镜观察这种发光的“标签”,科学家就能做到对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等一目了然。在一个活体中有数万种不同的蛋白质,这些蛋白质精细地控制着重要的化学进程。如果蛋白机制发生故障,通常就会t发生疾病。绿色荧光蛋白可帮助研究这类机制,这就是为什么绿色荧光蛋白成为生物科学极其重要的工具。在它的帮助下,科学家还能对各种细胞的命运了如指掌,比如,脑神经细胞是如何发育起来的,或者癌症细胞是如何扩散的…… 今天,已经有了许多新的不同的绿色荧光蛋白变体,这就进一步完善了绿色荧光蛋白作为基因标志在生物研究中的广泛应用。 发现与发展国外情况Aequorea victoria水母是一种生物发光体。1960年,下村修为搞清它的生物发光机制,参加了普林斯顿大学弗兰克·约翰逊实验室的工作。Aequorea victoria生物发光的活性组分曾被认为是一种与钙离子相关联的蛋白质,被称为水母素(水母素现在仍是一种检测生物体内钙离子的方法之一)。但在此形式下,所发射的是蓝光。对此,下村修曾做了大量的工作来说明所发射的荧光究竟是绿光还是蓝光。研究人员分离了大量的蛋白质,都显示出强烈的绿光,于是他在1962年写道:“由蛋白质所得的溶液在日光下是稍稍发绿的,但在钨灯下则为黄色,在紫外光下则呈现出很亮的、绿色的荧光”。应当说,对这一问题的认识是在不断提高的。他们在无直接试验证据的情况下,提出了绿色荧光蛋白所发的绿光是因受钙激发而发光的水母素,其能量向绿色荧光蛋白发生了转移所致。按现代的科学术语来说,水母素是作为一种能量给体,而绿色荧光蛋白则成为能量受体。这一观点,后来得到了实验的证实。但应当指出的是两种色素是独立存在的,并无依赖关系。虽然绿色荧光蛋白最初只是水母素研究中的一项偶然发现的“副产品”,但总的说来,下村修在发现绿色荧光蛋白的过程中作出了重要的贡献。如对其纯化和物理化学表征等方面,以及在不同条件下的激发光谱和发射光谱的测定等,绿色荧光蛋白与水母素两者间的能量转移,并解释了由绿色荧光蛋白发射的是绿光而不是蓝光。如果没有这些经典性开创工作,有关绿色荧光蛋白的出现和广泛应用将推迟几十年,甚至至今它仍作为一种秘密保留在太平洋中。 马丁·查尔菲所从事的研究是有关小线虫神经细胞的发展。当查尔菲第一次听说到绿色荧光蛋白时,他十分激动地从利用分子遗传学方法来研究线虫问题,转移到将绿色荧光蛋白与有机体中蛋白质基因相融合的工作,并先后在两种小线虫中得到表达,即绿色荧光蛋白在不同的有机体中显示出亮绿色的荧光,因此确认了绿色荧光蛋白可作为一种通用的基因标志,而应用于各种有机体中。接着,他还得到了绿色荧光蛋白在有机体内的不同部位和不同时间发展下的表达结果。1994年2月初查尔菲及其合作者把这些研究结果发表在《科学》杂志上,并引起轰动。1985年,道格拉斯·普瑞舍克隆了水母素的基因。1992年,他又克隆出完整的由238个氨基酸编码的绿色荧光蛋白基因。可惜的是,普瑞舍没有进一步尝试把该基因引入其他生物体内,虽然他在1992年的有关克隆工作的总结中最后指出:“迄今尚无可用的发色团生物合成的有关信息,而这种蛋白质的重组方式可以成为一种有价值的试剂,使我们可在这类特殊的蛋白质内,来试验发色团生成的生物化学,以及在水母素和绿色荧光蛋白间的能量转移机制等”。将绿色荧光蛋白表达到其他有选择的有机体这项工作,具有重大的生物学意义。这就涉及马丁·查尔菲的工作了。 绿色荧光蛋白的荧光形式不仅可用以表达小线虫、果蝇等,对哺乳动物的细胞也适用,从而使定量研究活细胞的动态过程成为可能。查尔菲等人的工作向人们展示出,绿色荧光蛋白作为一种通用的基因标志,在生物研究中有着无限的潜力。 钱永健的贡献钱永健及其合作者,还解决了绿色荧光蛋白的晶体结构问题,从而允许能够较合理地对具不同性质的变体合成进行设计。这些新变体有的荧光更强,有的呈黄色,有的呈蓝色,有的呈红色,有的可激活、可变色。这意味着除绿色以外,还可以用其他颜色荧光蛋白标示不同的蛋白质和细胞。今天,绿色荧光蛋白及其变体作为基因标志,已实现了工具化,有了通用的“工具盒”,可应用于所有生命体系中的科学研究。钱永健和他的同事不仅加深了对绿色荧光蛋白发光机制的了解,比如分子氧的作用,由此可以解释为什么绿色荧光蛋白在有机体内可容易地发射荧光。更重要的是发现了一些新的具有不同光谱行为的绿色荧光蛋白变体,从紫外部分一直位移到蓝色。这些结果表明,绿色荧光蛋白在进行取代或进行化学转换上是十分活泼的,而这些改进了的绿色荧光蛋白,为其在生物科学中的成功应用铺设了一条康庄大道。 在此笔者还想谈一点感想。虽然这一获奖项目为化学奖,但是它所涉及的大量工作都和生物和生命科学相关,包括所研究对象,以及它的实际应用等。这说明现代科学的分类已不拘泥于以往的格局。这还使我联想到目前我们化学家对于物理和生物科学的生疏,以及物理学家见到苯环结构而害怕的情况。这些现状表明,我们的大学教育确是有进一步改革的必要。 GFP的发光特性GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder). GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察. 尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测. GFP的性质GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450～490nm蓝光波长下更稳定. GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等. GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析. 但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白. 由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的. GFP的发现GFP是从一种生活在北太平洋寒冷水域的水母体内发现的。这种水母体内含有一种生物发光蛋白质——aequorin，它本身发蓝光。GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我们实际看到的颜色。GFP的纯溶液在典型的室光下呈黄色，但是当被拿到户外的阳光下时，它会发出鲜绿的颜色。这种蛋白质从阳光中吸收紫外光，然后以能量较低的绿光形式发射出来。 GFP的应用您可能要说：“谁会在乎水母体内的这种名不见经传的小小的绿色蛋白质呢？”GFP在科学研究上有着惊人的用途，因为它能够使我们直接看到细胞内部的运动。情况。在任何指定的时间我们都可以轻易地找出GFP在哪儿：你只需要用紫外光去照射，这时所有的GFP都将发出鲜艳的绿色。不妨做个实验：你把GFP连接到你有兴趣观察的任何对象上。比如，你可以把它连接到一种病毒上。然后，随着病毒在宿主体内不断扩散，你就可以通过跟踪发出的绿光来观察病毒的扩散途径；或者你把它接合到一种蛋白质上并通过显微镜观察它在细胞内部的移动。 GFP是一种现成的荧光蛋白质，因此它特别容易使用。大多数可以处理光的蛋白质都利用外来的分子吸收和释放光子。例如，我们眼睛里的视紫红质利用维生素来感光。这些“发光团”必须是专门为了发光而生成的，并且被仔细地插入到该蛋白质分子内，不同的是，GFP控制光的部位是其自身的一部分，仅由氨基酸构建而成，该部位含有一段三个氨基酸组成的特殊序列：丝氨酸－酪氨酸－甘氨酸（有时丝氨酸会被相似的苏氨酸取代）。当蛋白质链折叠时，这段短片段就被深埋在蛋白质内部，然后，发生一系列化学反应：甘氨酸与丝氨酸之间形成化学键，生成一个新的闭合环，随后这个环会自动脱水。最终，经过大约一个小时的反应，周围环境中的的氧气攻击酪氨酸的一个化学键，形成一个新的双键并合成荧光发色团。由于GFP可以形成自己的发色团，它非常适合于基因工程。你根本不必担心操作任何奇怪的发色团，你只需要利用遗传学的方法操纵细胞合成GFP蛋白质，GFP就会自动折叠并开始发光。 特性目前已有两个 GFP 有明确的生物特性 , 其一是水母中分离到的 GFP , 其二是海洋珊瑚虫中分离到的 GFP 。 1992 年 ,GFP 作为水母发光蛋白的配对物被分离到 , 作为辅助蛋白的 GFP 在水母中的功能是将其所产生的蓝光转换为绿光 , 这是因为它们之间进行了能量转换的缘故 , 在低浓度水母发光蛋白和绿色荧光蛋白溶液中 , 这种能量转换是无法进行的。但是 , 如果同时将水母发光蛋白和绿色荧光蛋白固定在一个表面上 ( 如 DEAE - Sephadex) 或在溶液中使用高浓度绿色荧光蛋白 , 则可以观测到绿光的产生。然而 , 为什么一些绿色荧光蛋白能与某种发光蛋白结合在一起 , 其机制仍不清楚。两个野生型 GFP 在 395 nm 出现一个最大吸收峰 , 在 470 nm 出现一个小的吸收。 395 nm 处的摩尔吸收值约为 9 500/ cm · mol 。出现两个吸收峰的原因可能是由于存在阴性和中性两个不同化学结构的生色团。正是由于存在两个吸收峰的缘故 , 野生型 GFP 可以被标准的长波紫外 (UV) 源和异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate , FITC) 所激发。 GFP 在 509 nm 处激发光最强 , 在 540 nm 处激发光较之为弱。激发态的寿命为 3. 25 ns , 其产生荧光的量值为 0. 72 ～ 0. 85 , 荧光素染料的荧光量值为 0. 91 。然而 , 天然 GFP 的摩尔吸收值却远低于荧光素 。水母 GFP 是由 238 氨基酸组成的单体蛋白质 , 分子量约 27 kD ,GFP 荧光的产生主要归功于分子内第 65 、 66 、 67 位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。翻译出的蛋白质折叠环化之后 , 在 O2 存在下 , 分子内第 67 位甘氨酸的酰胺对第 65 位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第 5 位碳原子咪唑基 , 第 66 位酪氨酸的α 2β键脱氢反应之后 , 导致芳香团与咪唑基结合。这样 , GFP 分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团 , 该过程可以自动催化完成。 GFP 晶体结构显示 , 蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构 , 长 420 nm , 宽 240 nm , 由 11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成 , 荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的 , 桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖 , 底部由一个短的垂直片段覆盖 , 对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内 。实验表明 GFP 荧光产生的前提是桶状结构完整性 , 去除 N 端 6 个氨基酸或 C 端 9 个氨基酸 ,GFP 均会失去荧光。这是由于生色团形成的效率较低 , 而且形成过程受外界环境影响较大的缘故 。 许多报道显示 , 天然珊瑚虫 GFP 作为生物学标记物 , 比水母 GFP 有更多的优点 , 具更大的前景。在光吸收方面 , 珊瑚虫 GFP 的消光系数比野生型的水母 GFP 高 5 倍 , 比人源化的红移 ( redshifted) 转变的水母蛋白高 2.5 倍 , 与水母 GFP 相比 , 珊瑚虫 GFP 稳定的 pH 范围更广 , 对有机溶剂、去污剂及蛋白酶的稳定性更高。珊瑚虫 GFP 在各种浓度中 , 均以可解离的同型二聚体形式存在。因此暴露在外的疏水表面较小 , 在细胞内与其他蛋白质相互作用的机会较小 在生物技术中的应用研究分子标记除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。这些都为传统生物学研究提供了新思路和新方法，成为交叉学科研究的热点。作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。1996年，Ehrdardt等人首次报道了利用GFP的特性研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成了一个环状物，且至少有9种蛋白在细胞分裂中起重要作用，尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。 药物筛选许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。 融合抗体在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂，其中很多涉及到信号分子在细胞器之间的迁移。例如当信号分子和某一特殊受体结合后常会导致配体-受体复合物从某一细胞区域迁移到另一区域，而这一迁移过程通常会介导一重要的生理功能。因而，这些受体常常被用作药物筛选的目标，若某一药物具有与信号分子类似的功能，那么该药物即具有潜在的医药价值。利用GFP荧光探针，将很容易从数量众多的化合物中判断出那些化合物具有与信号分子相似的能引起配体一受体复合物迁移并介导生理反应的功能，且这一筛选过程简单方便，所需成本也很低。利用这一原理，已经成功构建了一个筛选模型用于研究药物介导的糖皮质激素受体(hGR)的迁移过程。在一96孔板中培养细胞，并以一编码hGR GFP蛋白的质粒转染该细胞。当细胞用待筛选的药物处理后，hGR-GFP从细胞质迁移人细胞核的过程可实时或在某一时段内被证实，根据荧光分布即可推断哪一种药物具有与hGR配体相类似的功能。利用GFP来进行药物筛选由于受其必须与迁移的信号分子相偶联，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。近二十年来，抗体生成技术有了飞速发展，已经从细胞工程抗体(杂交瘤技术一单克隆抗体)发展到了第三代抗体：基因工程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，解决了人源抗体的研制问题，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发。单链抗体(Single-chain variable fragment，ScFv)是研究得较多的一种小分子抗体，其优越陛在于可在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。近年来，关于绿色荧光蛋白融合单链抗体的报道很多，国内也有相关报道，如程虹等报道将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功。因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。 生物传感器由于技术上的的原因，一般融合抗体均置于原核表达系统如E.coli中表达。为便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入一6×His序列，便于用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但这一技术也存在一些问题。由于抗体分子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。但近来也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体。若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。蛋白质工程技术已经开始采用将一具有信号传导功能分子识别位点的分子结合到另一分子上来设计生物感受器。绿色荧光蛋白由于其独特的光信号传导机制，以及在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用所影响的特性，因而极适于用做活细胞体内的光学感受器。第一个基于GFP的生物感受器为Ca2+感受器，由Romoser和Miyawaki几乎同时提出。这一感受器原理是利用钙调蛋白结合钙离子后引起的空间构象变化导致两种GFP突变体间发生荧光共振能量转移。但是由于大多数蛋白不能像钙调蛋白那样承受较大的空间构象变化，为克服这一缺点，人们开始提出利用基因融合技术将一新的分子识别位点结合到GFP上以构建新的分子感受器。Doi和Yanagawa根据这一原理将TEM1 β-内酰胺酶(Bla)融合到GFP上。当缺少目标分子时，GFP处于静止状态不会产生荧光。但是当目标分子β-内酰胺酶抑制蛋白(BLIP)与Bla结合后，即使GFP活化产生荧光，而这一变化很容易被检测到。将受体蛋白插入到GFP表面的技术已经成为构建分子感受器的有力工具，这种GFP感受器能被用来检测多种分子，如蛋白质、核酸、激素、药物、金属及其他的一些小分子化合物等，其潜在应用前景极为广阔。 GFP在细胞方面的应用Protein tagging GFP蛋白首先被应用在观察活体细胞中蛋白的位置及动态的变化.使用GFP进行此类研究的好处是细胞在实验之前不需要进行固定或破坏,如此便能在几乎不影响细胞的正常生理作用下进行即时的观察及分析.主要可以应用在Biological screen及Drug screen上. GFP蛋白除了能在细胞中标定特定fusion protein的位置及存在,另外也能利用生物分子之间的特殊作用力标定特定DNA序列的位置.例如有研究就利用bacterial lac repressor protein(lac I)跟其DNA目标之间的特殊强结合力来标定lacI的目标基因.GFP的barrel-like structure能确保GFP在fusion protein中的结构及其发光的性质,使其适宜接在不同fusion protein中表现.但利用GFP有期限制性,因为要将GFP折叠成具有活性(会发光)的形状可能会花较长的时间,这使得应用GFP在短生命周期的蛋白研究中相形困难. 1、测知transcriptase或reverse transcriptase的存在Monitoring of gene expression 将GFP当作报告子基因在生医研究上有很多的应用,主要分成下列两种: 在文献报道,利用具有hTERT (human Tolemerase Reverse Transcriptase)作用之promoter及拥有在此promoter下游GFP报告子基因的adenovirus来感染细胞,进而利用萤光的发光位置来辨认出肿瘤细胞的存在及其位移,发展的过程. 2、Promoter强度之研究 Promoter强度及其作用之研究对於有用到Molecular Cloning的实验来讲是非常重要的.利用GFP当作下游之reporter gene可以让研究者即时观察得知promoter在不同细胞或在不同状况下表现下游基因的能力. FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 利用Fluorescent Energy donor及acceptor之间的能量传递而造成发光波长的改变来得知donor和acceptor之间的相对位置关系,进而作为蛋白间交互作用研究的有力证据及资料. GFP 在信号转导中的应用新近研究发现 , 某些突变的 GFP 能够发生荧光共振能量转移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) 。 FRET 是一种从荧光分子的激发状态到临近基态接受分子之间量子力学能量转移的现象。 FRET 发生的前提条件是 , 荧光接受分子必须在荧光提供分子释放态所具有的波长范围内接受能量。如果供应分子和接受分子相互定位在几个纳米之内 , 则非常利于 FRET 的产生。因为 FRET 对于两个荧光分子相互间的定位和距离高度敏感 ( 在纳米范围内 ) 。两个分子间微小的线性或空间定位关系的破坏可以强烈地改变能量转移的效率。由于 FRET 能量转移并非是 100 % 的效率 , 一个实用而有效的检测 FRET 的方法是 , 仅仅激发荧光供应分子 , 然后计算供应分子对于接受分子荧光释放的比率。比值的变化是一个理想的观测细胞动态变化的指标。因为它消除了 GFP 分子在绝对浓度、细胞的厚度、激发源的能量度以及检测的绝对效率等的影响。利用 FRET 可以作成 GFP 依赖的生物探针 , 现已有研究人员设计大分子或分子配对物来改变 GFP 之间原有生理信号反应的 FRET 。在上述实验基础上 , 研究人员开始设计 FRET 依赖的 Ca 2+ 敏感指示剂 , 其设计原理是 , 钙调蛋白 (CaM) 通过肌球蛋白轻链激酶 (MLCK) 结合到 CaM 结合区。蓝色荧光蛋白和绿色荧光蛋白通过 CaM 和 MLCK 区域融合在一起 , 当 Ca 2 + 增多时 , 形成更多的 Ca 2+ - CaM 复合物 , 并从 MLCK 结合到 CaM 结合区域。该实验发现 , 通过改变两个 GFP 之间的距离 , 可以增加 FRET 。另有一些研究人员 , 并没有把两个 GFP 融合在一个单一结构中 , 而是把一个 GFP 融合到 CaM 上 , 另一个 GFP 融合到 CaM 结合区域 。结果发现 , 当 Ca 2+ 结合到 CaM 上 , 出现分子间异源二聚体 , 两个 GFP 足够接近而产生 FRET 。这个实验提示了一个非常重要的现象 , 即 FRET 不仅可以在分子内发生 , 而且还可以在分子间发生。研究发现可以通过调节 GFP 来改变 FRET 。把一个释放蓝色荧光的 GFP 融合到一个绿色荧光 GFP 突变体上 , 并在它们之间介入一个蛋白酶敏感的间隔子 , 这两个 GFP 恰好可以发生 FRET , 当加入蛋白酶时 , 间隔子被切除 , 两个 GFP 之间的距离发生弥散性改变 , FRET 被完全阻断 。该实验提示我们 , 可以通过偶联 GFP 到适当的转录因子、跨膜受体、细胞间信号转导指示分子 , 来动态观测活细胞的生理功能。 最近 , 有学者用 GFP 依赖的生物传感器测量活细胞内生化动力学 , 通过利用带有 GFP 标记的蛋白激酶 A 转染细胞 , 观测有关 cAMP 的动态荧光变化 。通过融合蓝色荧光 GFP 到调节亚单位或融合绿色荧光 GFP 到 PKA 的催化亚单位 , 设计出了 cAMP 传感器。当 cAMP 浓度很低时 , 两个荧光分子距离很近 , 并出现 FRET , 如果增加 cAMP 浓度 , 发生 FRET 的可能性急剧下降。利用该方法 , 可以检测出 cAMP 的动态变化 , 并开创了在整体条件下 , 研究 cAMP 调节信号转导途径的新方法。 GFP 的结构虽然具有高度完整性 , 但是实验中发现 , 在 GFP 中某些确定的位置 , 插入外源基因 , 完全没有丧失其荧光性。当把 CaM 插入黄色荧光 GFP 突变体中 , 得到 Ca 2+ 传感器 , 当 Ca 2+ 结合到 CaM 上 , 导致生色团去质子化 , 使荧光强度增加 7 倍。当在黄色荧光 GFP 中插入一个 Zif268 锌指结构 , 可以得到传导 Zn 2+ 的 GFP , 结果发现荧光少量增加 , 为改变前的 1.7 倍 , K d 值约 0. 4mmol 。插入外源基因致使 GFP 荧光敏感性增强的现象 , 提供了一个获取永久编码传感器去监测细胞信号转导的新路径。 改进 GFP 的应用前景野生型 GFP 合成后需经一定的折叠过程形成正确构象后才有功能 , 而且在 470 nm 处的荧光强度相对较低。为了改善 GFP 荧光特性 ( 如摩尔吸收值及释放波谱 ) , 对 GFP 进行了突变和重组实验。 Chalfie 等 通过测定大肠杆菌和线虫体内重组 GFP 的荧光光谱发现 , 它和提纯的天然 GFP 光谱完全一致。突变实验发现 , 多数突变导致 GFP 部分或完全丧失荧光活性 , 但某种突变使 GFP 明显地改变激发和释放波谱。例如用 The 替代 Ser 65 , 在 490 nm 处出现一个单一激发峰值 , 激发后产生的荧光强度是野生型的 6 倍 , 对光淬灭具有更强的抵抗性 , 并且出现红移现象 , 该突变蛋白质与 FITC 的性质相似 ; 同样 Leu 替代 Phe 64 , 即增加 GFP 的可溶性 , 荧光强度增强 35 倍。 3 个氨基酸同时突变时 , 在 360 nm 至 400 nm 之间 , 出现最大激发峰 , 而且增大生色团形成的机率 , 可溶性更强 , 荧光强度为野生型 GFP 的 18 倍。现有人认为 , 低浓度 GC 含量是 GFP 低表达的原因之一 , 为此 , 研究人员合成了高 GC 含量的特殊 GFP , 并且发现这种 GFP 有更强的荧光强度 。此外 , 用人蛋白质中偏爱的密码子替代相应的野生型 GFP 中密码子可提高 GFP 在哺乳动物中的表达效率。许多 GFP 突变蛋白 , 不仅改变了激发和释放波谱 , 而且提高生色团形成的效率、溶解度、蛋白质表达等 。到目前为止 , 荧光蛋白已有非常广泛的应用 , GFP 可应用于转染细胞的确定 , 体内基因表达的测定 , 蛋白质分子的定位和细胞间分子交流的动态监测 , 免疫分析、核酸碱基探针分析 , 以及分子间第二信使钙离子和 cAMP 水平的指示 , 细胞间隙 pH 变化的检测 。另外 ,GFP 也可以和其他蛋白质形成融合蛋白 , 作为基因治疗检测指标 。但是 ,GFP 在应用中还发现有许多问题亟待解决 : (1) 荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难 , (2) 多数生物具有微弱的自发荧光现象 , 并有着类似的激发和发射波长 , 这个荧光背景会影响某些 GFP 的检测 , (3) 实验中发现很难建成 GFP 稳定细胞株 , 可能与 GFP 参与细胞凋亡过程有关。不同的突变体给应用提供了更广阔的前景 , 但是也发现某些突变体在生理变化的 pH 值范围内显示了更大的敏感性。研究人员利用一个 pH 敏感的 GFP 突变体检测细胞质、细胞核、高尔基体和线粒体基质中的 pH 值 , 发现在这些区域测量到的数值与以前报道的测量值有非常好的吻合 。 GFP 依赖的 pH 检测子 , 与小分子染料不同 , 这种检测手段不必考虑染料渗透、环境水解等一系列问题 , 且 GFP 具有高度选择定位性 , 适合于所有对于基因转染敏感的细胞。更重要的是 , 这个实验说明利用组织特异性启动子 GFP 检测特定组织 , 通过融合到目的蛋白 , 可以检测特定类型的细胞、细胞器或特定的细胞内区域中的 pH 值。这样开创了检测以前所不能到达部位 pH 值的可能性。 光伏发电瑞典研究人员不再盯着植物作为样板，转而将目光投向拥有高超光伏转化能力的水母，开发出提升收获太阳能的技术。利用水母身上提取的绿色荧光蛋白（GFP），该小组制作的装置可用这些“黏黏绿”将紫外光转化为自由电子。该小组制造的电池由在二氧化硅基底上被一个小缝隔开的两个简单的铝电极组成，GFP置于两电极中间并起连接作用。当把紫外光放进来的时候，GFP不断将光子抓走，并产生电子进入电路产生电流。同时，GFP非常廉价，不需要昂贵的添加剂或昂贵的加工，此外，它还能被封装成独立的不需要外光源的燃料电池。科学家相信，此能源装置缩小后可用来驱动微小的纳米设备。 GFP的结构在蛋白质编号lema中可以看到GFP发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得到了保护。发色团（如右图）由蛋白质链上的三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或丝氨酸）自发形成。 诺贝尔化学奖2008年10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura（下村修）、哥伦比亚大学的Marin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健，钱学森的堂侄）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得诺贝尔化学奖！ GFP：通用成帧规程GFP，即通用成帧规程 （Generic Framing Procedure）。通用成帧规程属于ITU-T G.7041规范，是一种新的封装规程。在MSTP中，除可以使用传统的点到点协议/高速数据链路协议（PPP/HDLC）、SDH上的链路接入规程（LAPS）作为数据分组的封装协议外，GFP 是一种新的选择方案。GFP 具有成帧映射和透明映射两种方式可以分别应对不同需求的业务。成帧映射需要将客户数据缓存下来再封装到 GFP 帧结构中，此方式适用于对时延、抖动不敏感的业务；对于那些需要更小时延以及更高传输效率的业务，可以采用透明映射方式，即直接将数据从客户数据块中取出，再映射进周期性的、长度固定的 GFP 帧结构中。 |
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