简介

反应原理(Feulgen反应 Unna染色法)

简介

专一显示DNA的一种染色法。标本经水解去掉RNA后，DNA的嘌呤—脱氧核糖糖苷键中的嘌呤被酸水解，暴露出了脱氧核糖的醛基，游离的醛基同Schiff‘s试剂反应，呈紫红色。

反应原理

Feulgen反应

DNA经弱酸（1mol/L HCl）水解后，嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键被打开，并且使脱氧核糖与磷酸间的磷酯键断开，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。醛基在原位与Schiff（无色品红亚硫酸溶液）试剂结合，形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生是因为反应产物的分子内有醌基（醌基是一个具有颜色的发色团），所以凡含有DNA的部位，就呈紫红色。而RNA用此法处理后则分解。

Unna染色法

1899年Pappenheim 首创了甲基绿-哌洛宁（mehtyl-green-pyronim）染色法。1902年Unna对这一方法进行了改良。 1940年Brachet研究证明用甲基绿—哌洛宁对DNA和RNA有选择性的染色效果。碱性的甲基绿-哌洛宁混合染料处理细胞后，由于DNA、RNA对染料具有的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。 DNA被甲基绿染成绿色，RNA被哌洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来。

三、材料、试剂和仪器

1． 材料

洋葱根尖， 洋葱鳞茎表皮细胞

2． 试剂

1）Carnoy固定液： 无水乙醇：冰醋酸 = 3：1

2）95% 乙醇

3）70% 乙醇： 95% 乙醇 70mL 加水 25 mL

4) 5% 三氯乙酸(TCA)：固体TCA 5g，加水溶解到100 mL。

5) 1N HCl (当量盐酸)

6) Schiff 试剂：煮沸200mL 水，稍冷放入1g 碱性品红，充分搅拌有助溶解，50℃时过滤，置磨口棕色瓶内，向滤液中加1N HCl 20mL ，待25℃时加亚硫酸氢钠或亚硫酸钾 1g ，盖严放暗处，静止勿动，几天后，红色稍退，溶液呈无色或淡黄色，即可使用，如有红色，可加一勺活性炭，振荡过滤，黑布罩好。

7) Unna 染色液（甲基绿-哌洛宁G）

溶液A: 5% 哌洛宁G 水溶液 17.5 mL

2% 甲基绿水溶液 10 mL

蒸馏水 250 mL

溶液 B：0.2mol/L 的pH为4.8的 醋酸盐缓冲液。配法：先将1.2mL 醋酸液用水稀释到100mL，再将2.7g的醋酸钠用水稀释到100mL，然后将醋酸和醋酸钠两液按77mL和100mL的比例混合。

在应用前，把A液和B液按等量混合，混合液可以保存一周时间，时间长效果不佳。