光脱色荧光恢复技术　FRAP

FRAP :fluorescence recovery after photobleaching. 不仅能够证明膜的流动性，同时也能测量膜蛋白扩散的速率。

脱色恢复技术是研究膜蛋白或膜脂流动性的基本实验技术之一。用荧光素标记膜蛋白或膜脂，然后用激光束照射细胞表面某一区域，使被照射区的荧光淬灭变暗。由于膜的流动性，淬灭区域的亮度逐渐增加，最后恢复到与周围的荧光强度相等。根据荧光恢复的速度可推算出膜蛋白或膜脂扩散速度。

研究膜流动性的一种方法。首先用荧光物质标记膜蛋白或膜脂, 然后用激光束照射细胞表面某一区域, 使被照射区域的荧光淬灭变暗形成一个漂白斑。由于膜的流动性,漂白斑周围的荧光物质随着膜蛋白或膜脂的流动逐渐将漂白斑覆盖，使淬灭区域的亮度逐渐增加, 最后恢复到与周围的荧光光强度相等。

细胞膜蛋白的标记方法有很多种。可以用非特异性的染料,如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)将细胞膜蛋白全部进行标记。也可用特异性的探针,如荧光抗体,标记特异的膜蛋白。膜蛋白一旦被标记就可用激光束进行局部照射处理,使荧光脱色,形成直径约为1μm的白斑。若是可移动的膜蛋白,则会因蛋白的移动,使白斑消失,若是不能移动的蛋白.则白斑不会消失。

根据荧光恢复的速度, 可推算膜脂的扩散速度为每秒钟为几个微米，而膜蛋白的扩散速度变化幅度较大，少数膜蛋白的扩散速度可达到膜脂的速度，大多数蛋白的扩散速度都比膜脂慢，还有一些膜蛋白完全限于某一个区域。正是这种限制，使膜形成一些特定的膜微区(membrane domain),这些微区具有不同的蛋白组成和功能。这实际上是膜蛋白不对称分布带来膜功能的不对称。

FRAP技术也有它的不足之处。第一,它只能检测膜蛋白的群体移动,而不能观察单个蛋白的移动。其次,它不能证明膜蛋白在移动时是否受局部条件的限制。为了克服这些不足,发展了单颗粒示综(single-particle tracking,SPT)技术,可以用抗体金(直径15～40 nm)来标记单个膜蛋白,然后通过计算机控制的摄像显微镜进行观察。