DNA限制性内切酶消化是基因分析中的关键步骤。内切酶是最关键的工具酶。限制性内切酶是一类具有严格识别位点，并在识别位点内或附近切割双链DNA的脱氧核糖核酸酶。一定的 DNA分子的核苷酸顺序是一定的，某种限制性内切酶作用于该DNA的切点数一定，故所得的 DNA片段数和片段的大小也一定，通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酸胺凝胶电泳分离，以标准 DNA作对照，溴化乙锭染色后，测出各 DNA片段移动的位置和距离。以各标准 DNA片段的分子量对数为纵坐标，各标准 DNA片段的移动距离为横坐标，求出各样品DNA片段的分子大小。

[操作]

[注意事项]

[试剂和器材]

[操作]

l．样品DNA的限制性内切酶消化

（1）取 2μg样品 DNA溶液加入 0.5ml的 Eppendorf管中，加2μl 10×限制性内切酶缓冲液，6～10个U的相应限制性内切酶，加消毒双蒸水至总体积20μl，于37℃保温酶解2小时，按上述条件用适当的几种不同的内切酶进行单酶或双酶解。

（2）在 65℃加热 5分钟或用适量的 0.5 mol/L EDTANa2终止反应。

2．DNA酶解片段的电泳分离

取DNA酶解作品2μl加上样缓冲液10μl（含溴酚蓝指示剂和甘油），在0.8%琼脂糖（含0.5μg/ml溴化乙锭）凝胶进行水平电泳，电压<5V/cm，时间2小时左右，用紫外灯观察分析。

[注意事项]

1．分子克隆是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。

2．要注意酶切时加样的次序，一般次序为水、缓冲液、DNA各项试剂，最后才加酶液。取液时，Tip头要从溶液表面吸取，以防止Tip头沾去过多的液体与酶，待用的内切酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20℃冰箱，防止限制性内切酶的失活。

3．凡用在酶切反应中的一切塑料器皿（Eppendorf管，Tip头等），都要新的，最后用重蒸水清洗，湿热灭菌，置50℃温箱中烘干，使用前打开包装，用镊子夹取，不直接用手去拿，严防手上杂酶污染。

4．当样品在37℃与65℃保温时，要注意：

（l）防止因盖子未盖严密使水汽进入管内，使反应溶液体积大量增加，造成实验失败。

（2）防止由于标签脱落，分不清样品类型。

5．由于温差原因，往往在盖上有水汽，因此样品酶切完毕或中间取样电泳要离心2秒钟，以集中体积内溶液，否则会发现酶切后体积少了。

[试剂和器材]

1．试剂

（1）限制性内切酶：如 EcoRI、Hind Ⅲ、PstⅡ、BamH1等，-20℃贮存。

（2）样品 DNA：如 λDNA、pBR322等，-20℃贮存。

（3）限制性内切酶缓冲浪配制，见下表（用消毒双蒸水配制，贮存于-20。C）；

（4）10×TBE电泳缓冲液:0.89 mol/L Tris；0.89 mol/L硼酸；0.02 mol/L EDTA Na2 pH8.0，高温灭菌，贮存于4℃。

（5）6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝；40%蔗糖；用消毒双蒸水配制，贮存于4℃。

（6）溴化乙锭溶液：称取溴化乙锭5mg溶解于lml消毒双蒸水中，4℃避光保存。

（7）消毒双蒸水。

2. 器材

恒温水温箱；电泳仪；水平电泳糟；50μl可调移液器；紫外灯（上海康华生化仪器制造厂）。