限制性内切酶（restriction endonuclease）也称限制性酶（restriction enzyme），是由W. Arber，H. Smith和D. Nathans等人（1979年）从细菌中分离的一类酶。限制酶具有极高的专一性，识别双链DNA上特定的位点，将两条链都切断，形成粘末端或平末端。限制酶可以用来解剖纤细的DNA分子，在分析染色体结构、制作DNA的限制酶谱、测定较长的DNA序列、基因的分离、基因的体外重组等研究中是不可缺少的工具。对于研究DNA的分子生物学家来说，这是一把天赐神刀——分子生物刀。