双重标记实验用于检测同一细胞内两种不同抗原。该方法应用两种不同荧光染料标记的抗体分别检测不同抗原。由于在同一个样本使用两种染料，为此就要求每一种检测试剂仅能识别一种抗原。有3种方法能够达到这一目的。 最确定的方法是直接标记一抗。例如，当应用针对不同抗原的两种特异性纯化单抗时，将其中一种标记FITC，另一种标记Texas红。只要这两种单抗本身适合进行荧光标记，一般均会得到满意的结果。