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词条 cDNA
释义

DNA(Deoxyribonucleic acid),中文译名为脱氧核糖核酸,是染色体的主要化学成分,同时也是基因组成的,有时被称为“遗传微粒”。与RNA链互补的单链DNA,以其RNA为模板,在适当引物的存在下,由RNA与DNA进行一定条件下合成的,就是cDNA。

定义

cDNA 互补脱氧核糖核酸

为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary DNA之缩写,或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA,以其RNA为模板,在适当引物的存在下,由依赖RNA的DNA聚合酶(反转录酶)的作用而合成,并且在合成单链cDNA后,在用碱处理除去与其对应的RNA以后,以单链cDNA为模板,由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA,在遗传工程方面广为应用。在这种情况下,mRNA的cDNA,与原来基因的DNA(基因组DNA,genomic DNA)不同而无内含子;相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上,与exon序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。cDNA同样可以被克隆。

构建

分为六个阶段:

阶段1:反转录酶催化合成cDNA第一链

阶段2:cDNA第二链的合成

阶段3:cDNA的甲基化

阶段4:接头或衔接子的连接

阶段5:Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA

阶段6:cDNA与λ噬菌体臂的连接

详解

一).构建cDNA文库:

以生物细胞的总 mRNA 为模板,用反转录酶合成互补的双链 cDNA ,然后接到载体上,转入到宿主后建立的基因文库就是 cDNA 文库。

1、mRNA的提取及其完整性的确定

1) 总 RNA 的提取

RNA 提取方法:APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA

2)mRNA 的分离

高等真核生物 mRNA 分子的 3' 端均有 poly(A) 尾,将总RNA通过寡聚(DT)纤维柱分离mRNA或利用磁珠法制备纯mRNA。在某些情况下,裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物作为提取mRNA的替换途径。

3) mRNA 的纯化 ①按照大小对总 mRNA 进行分级,主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级;②多聚核糖体的免疫学纯化法,这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。

4)mRNA 完整性的确定

确定 mRNA 完整性的方法有三种:

① 直接检测 mRNA 分子的大小;

② 测定 mRNA 的转译能力;

③ 检测总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。

2、 cDNA 的合成和克隆

1) cDNA 第一链的合成

用亲和层析法得到 mRNA 后,根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理,用 12~20 个核苷酸长的 oligo ( dT )与纯化的 mRNA 混合, oligo ( dT )会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物,反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo ( dT )结合在 mRNA 的 3' 端,因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端,有时这种全合成难以达到,尤其是 mRNA 链很长时,为此建立了一种随机引物法合成 cDNA 。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸,由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo ( dT )仅与 mRNA 3' 端结合不同,它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前,必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链,即形成双链 DNA 分子。

2). 双链 cDNA 的合成

合成 cDNA 第二条链有两种方法。一种方法是利用 cDNA 第一链的 3' 末端常常出现发夹环的特征,这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果,它为合成 cDNA 第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链 cDNA 在一端有一个发夹环,可以用单链特异的 S1 核酸酶切去。但是 S1 核酸酶的处理,常常会“修剪 ” 过多的 cDNA 顺序,使 cDNA 丢失了 mRNA 5' 端的部分顺序。 另一种方法是用大肠杆菌的 RNase H 进行修饰。 RNase H 能识别 RNA-DNA 杂交分子并把其中的 RNA 切割成短的片段,这些 RNA 短片段仍与 cDNA 第一链结合,可被新合成的 DNA 所取代。新合成的 DNA 存在切口,用 DNA 连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的 DNA 链。 RNase H 法优于 S1 核酸酶法,它能获得包括 mRNA 5' 端全部或绝大部分的更长顺序 cDNA 分子。

3) 将 cDNA 重组到载体上 合成的 cDNA 与载体 DNA 进行连接一般有 3 种方法:

① 借助于末端转移酶的 3' -OH 端合成均聚物的能力,双链 cDNA 和线性化载体 DNA 的 3' -OH 端分别加上均聚核苷酸链;

② 双链 cDNA 和线性化载体 DNA 分别用 Klenow 片段进行末端补平,然后用 T4 DNA 连接酶进行齐头连接,形成重组体;

③ 通过粘性末端连接。

4). 转化

重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌,形成携带质粒的菌株。当不同重组的 DNA 含有不同的 cDNA 基因时,整个转化子含有来自 mRNA 群体的各种 cDNA 基因,这样的转 化子群体构成该 mRNA 全部遗传信息的 cDNA 基因文库。

5). 目的 cDNA 克隆的鉴定

用于从 cDNA 文库中筛选和鉴定目的 cDNA 的方法主要有 3 种:

① 核酸杂交 ② 免疫学杂交检测 ③ cDNA 同胞选择

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更新时间:2025/3/1 21:01:07