一．金属螯合亲和层析

二．金属螯合亲和层析用于生物分离纯化

金属螯合亲和层析（MCAC）是近30年来出现的一种亲和层析技术，也称固相化金属离子亲和层析。它于1975年首先被Porath和他的合作者们成功用于分离纯化人血清蛋白。并在此后的三十年里迅速发展。该方法是利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和载体之上的金属离子之间的相互作用而进行的亲和纯化。它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。目前，对于MCAC的研究主要集中在新的金属螯合基质的研究以及层析条件的优化等方面。另外，研究发现，MCAC不仅适于某些蛋白质、酶和氨基酸与肽的分离纯化，也适用于能可逆螯合金属离子的核苷酸、激素、抗体等物质的分离和纯化。随着对金属螯合技术的进一步研究开发，其应用也必将越来越广泛。本文将对金属螯合亲和层析的主要应用进行介绍和归纳。

一．金属螯合亲和层析

1．作用原理

固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面的氨基酸与固定化金属离子的亲和力的不同来进行蛋白质分离的一项技术。过渡态金属离子能够与电子供体，如氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，当它在溶液中会被水分子或阴离子占据。然而，当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时，氨基酸残基的供电原子就会与金属离子结合形成复合物，取代原先结合的水分子或阴离子，这样就能使蛋白质分子结合在固体表面。能与螯合反应的基团很多，例如氨基酸中的氨基和羧基，以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原子，但是，由于蛋白质表面的氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同，因而具体使用时根据金属配基的亲和力大小不同，选择不同的金属配基加以分离纯化。

2．优点及影响条件

MCAC在生物分子纯化方面具有很多优点：(1)与蛋白结合力强，结合容量大，可用于工业生产，如采用MCAC吸附介质的扩张床吸附技术可从哺乳动物细胞培养粗提物中一步分离纯化溶解性目标蛋白；(2)洗脱条件温和，再生后配体恢复完全，一种MCAC树脂可再生几百次而不改变其层析特性；(3)价格便宜；(4)可通过改装各种金属离子，引入目标蛋白质最适宜的金属离子进行不同蛋白质的纯化。鉴于上述特点，使MCAC适用于某些蛋白质、酶、氨基酸及肽的分离纯化以及可逆螯合金属 离子的核苷酸、激素、抗体等物质的分离和纯化。

影响MCAC蛋白纯化效果有很多，但其中洗脱条件是主要因素，包括洗脱液pH、组成及离子强度。其中pH通过质子改变金属配体的负电性及氨基酸残基上的质子化程度而进行洗脱效果的调节。洗脱液的组成可改变的范围较广，多种途径共同调节着纯化效果。

二．金属螯合亲和层析用于生物分离纯化

1．用于分离纯化变性蛋白

MCAC特别适合分离纯化变性蛋白，尤其是带6个组氨酸标签的重组蛋白。这种基因工程蛋白与料液中的其他蛋白质相比。对金属离子有更高的特异性，在分离纯化后再用化学法或酶法将标签切掉，从而得到目标蛋白。这种方法广泛应用于大肠杆菌表达包涵体蛋白质的分离及纯化，是分离纯化生物工程蛋白质产品最有效的工具之一。Ueda等应用 N 亲和层析并结合分子筛层析，分离纯化了大肠杆菌表达的人催乳素，经鉴定分析，纯度达到99，5％，经Nb2细胞增殖活性分析，该重组蛋白的生物活性达40，9 IU／mg。

2．用于纯化酶

MCAC优越的性能使它在酶的纯化方面也有广泛应用，特别是在超氧化物歧化酶(SOD)的纯化方面。超氧化物歧化酶是机体内超氧自由基的天然清除剂，是一种广泛存在于动植物和微生物中的金属酶，有广泛的应用，具有重要的理论及实用价值。研制开发重组人超氧化物歧化酶不仅可解决人源SOD的材料来源有限和因血制污染而带来的安全性问题 ，而且可避免异源SOD在临床应用时可能出现的免疫性过敏反应。所以有必要建立简便有效的纯化方法，来获得较高纯度的SOD。通过MCAC法，SOD中所含相对较多的组氨酸上的咪唑基可与螯合柱上金属离子特异结合，通过特殊洗脱而分离纯化。

3．用于蛋白质的分析

金属螯合亲和层析可用于蛋白质的分析鉴定。Jiang等通过金属螯合亲和层析结合金属离子亲和毛细管电泳技术(IMACE)对糖基化导致13t一胰凝乳蛋白酶结构变化进行了研究，证明糖基化作用产生两个截然不同的蛋白质，他们对金属离子的亲和性完全相反。

MCAC还可用于磷酸化蛋白分析。蛋白质的磷酸化和去磷酸化是生命体代谢调控的重要机制，它能引起结构的变化，从而进行传递信息。在进行蛋白质的结构与功能分析时，区分磷酸化和未磷酸化的蛋白是十分有益的。已发现MCAC能鉴定磷酸化的蛋白，尤其是 Fe3-MCAC已被用来选择性纯化和浓缩磷酸化的蛋白和多肽 。

MCAC与重组技术相结合可以使带六聚组氨酸的蛋白质固定在基质上，从而为研究蛋白质的相互作用开辟了新的途径。如Celia等用Ni负载的金属螯合脂质定向膜捕获组氨酸标记的MHC分子，再通过表面等离子体共振技术考察它们对 T细胞受体的结合。锚定蛋白质的NTA组氨酸标记体系也可被用来通过原子力显微镜测量受体一配体在单分子水平上的结合力。

4．用于蛋白质的复性

金属螯合亲和层析用于蛋白质的复性在基因工程技术中，表达的重组蛋白多以包涵体形式存在蛋白质经常会错误折叠而损失活性，这一难题长久以来都没有得到很好的解决。高浓度的变性剂可以溶解包涵体，然后控制变性剂除去的速度，有时需要添加适当的氧化／还原试剂，蛋白质可以逐步折叠复性。通常使用的复性方法有三种，分别是稀释复性，透析复性和层析复性。其中稀释复性和透析复性过程中会有大量无活性蛋白质聚集体形成，而金属螯合亲和层析复性中，蛋白质能可逆吸附在固相介质上，可避免伸展的多肽分子之间形成聚集体。

5．其他领域的应用

过渡金属亲和吸附蛋白的特性也成功应用在生物传感器和蛋白质芯片领域。Zhu等提到了将带有6个组氨酸的蛋白质固定于镀镍的玻璃板上，得到了比常规醛处理表面更高质量的蛋白质芯片。在酵母的蛋白质组学研究中，通过克隆表达5800个开放阅读框，将相应的蛋白质纯化后固定于镀镍板上可以筛选能与磷脂相互作用的蛋白质，应用这种技术鉴定了许多新的可与钙和磷脂相互作用的蛋白质。