基因靶技术（gene targeting）

一、基因靶技术的原理

基因靶技术的原理是设计一个靶载体，其内含有与靶位点相同的核苷酸序列，用基因转移的方法将载体导入靶细胞，通过载体与靶位点相同的核苷酸顺序间的同源重组，使外源DNA序列定点整合入靶位点，从而达到对靶位点进行定点修复或定点突变的目的。载体分两种：一是序列插入型载体，通过与靶点序列的单交换导入外源序列；二是序列取代型载体，通过与靶点序列间的双交换，用外源序列取代靶序列。

二、基因靶技术的作用

（一）确定基因表达水平

目前应用最多的基因转移途径—逆转录病毒载体介导的基因转移存在二个问题，一是导入的外源基因难以生理方式进行表达；二是即使表达也不够完善。采用基因同源重组的基因靶技术，可使病变的基因在原位得到改正，与正常基因的结构与调控环境一致，即以生理方式来进行表达。1989年Thomphon采用小鼠胚干细胞HPRT基因的同源重组置换，使HPRT缺陷功能得到恢复。

（二）增强基因表达的稳定性与安全性

通过逆转录病毒载体，将目的基因导入靶细胞后，随时间的推移，目的基因表达的稳定性会有所下降，表达的活性会慢慢的降低，有的甚至完全停止表达。同样，外源基因与靶细胞染色体基因组的整合位点是随机的，常可导致基因的丢失和重排而失去表达活性。采用基因靶技术则可避免上述二种情况的发生，防止逆转录病毒载体的回复突变成致病性的野生型病毒、原癌基因的激活、正常功能基因的插入失活等，从而增加基因转移的安全性和稳定性。

（三）提高逆转录病毒载体的滴度

逆转录病毒载体-包装细胞系基因转移系统是目前基因治疗中最有效的基因转移方法。但是包装细胞系培养上清液中重组逆转录病毒载体的滴度相对较低，是影响基因转移效率的一个重要因素。采用基因靶技术则可提高逆转录病毒载体的滴度，包括逆转录病毒载体本身的改建和包装细胞系的改建两个方面。Armentano等将gag基因进行不完全缺失，保留421个碱基，这一改建，不仅保证逆转录病毒载体(N2)的安全性，同时也将其滴度提高了10~40倍。Gelinas将β-球蛋白启动子序列缺失，使逆转录病毒载体的滴度提高了10倍。在细胞包装系改建方面，Anderson等研究了包装细胞其组织、种属来源对滴度的影响。鉴于目前基因治疗中应用的逆转录病毒载体，大部分是由molv改建的，因此，其包装细胞系也常采用PA317等小鼠成纤维细胞系，一般都被产出105~107cfv/ml的病毒滴度，完全能够满足基因治疗的需要。

三、基因靶技术在基因治疗中的应用

靶技术在基因治疗中的应用主要包括三个方面：①基因分解，即利用靶技术将外源基因定点导入靶细胞染色体基因组的某一位点，使基因打断，此方法又称为基因插入突变；②基因增加，即将外源基因导入靶基因染色体上精确位点，使基因表达的蛋白，具有外源基因和内源基因共同决定的融合蛋白的性质；③基因修正，即将外源基因导入靶细胞内，纠正突变的基因。基因靶技术不仅在肿瘤的基因治疗中应用，也可用于癌基因的研究，如利用基因靶技术，对癌基因或原癌基因进行定点突变，从而观察基因突变引起细胞恶性病变的机制。