1 PCR技术

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）又称“体外的基因扩增”是由美国某公司和加利福尼亚大学于1985年共同合作开发的一项基因工程技术。这一技术可以在几个小时内将pg（10-9g）水平的单链拷贝序列扩增至上百万倍，已广泛的在于多领域得到了应用[1]。近些年来，PCR技术得到了不断的完善，并衍生出了多种PCR技术（如反向PCR、多重PCR等技术）以及与PCR技术相关联的其它新技术（如RAPD、AFLP等分子标记技术）。

1.1 PCR技术的原理

PCR的基本原理是利用聚合酶依赖于模板的特征，在体外模仿体内天然的DNA复制过程。复制过程被限定在一对人工合成的寡核苷酸之间。这段寡核苷酸被称为“引物”，长度通常为20个核苷酸。

1.2 反应过程

PCR反应主要包括三个步骤：（1）DNA变性，它是加热使模板DNA双链解离，形成两条单链的过程；（2）引物退火，即将反应温度降低，使两个引物分别与变性的两条模板DNA单链的3’—端配对，这一过程也被称为复性；（3）延伸，在四种脱氧三磷酸核苷存在的条件下，由DNA多聚酶催化，使引物沿模板DNA单链的3’→5’方向延伸，合成出一条新的DNA链。

1.3 反应物主要成分

（1）寡聚核苷酸引物；（2）DNA模板；（3）dNTPs；（4）聚合酶（关键性试剂）。

1.4 基本操作

（1）依次在灭菌的微量塑料管中加入下列溶液，混匀后待用。

灭菌去离子蒸馏水 30μL

10倍扩增缓冲液 10μL

四种dNTPs溶液（1.25mmol/L/每种） 16μL

引物1（100pmol，溶于去离子水） 5μL

引物2（100pmol，溶于去离子水） 5μL

模板DNA（根据浓度取不同的量，一般为2μg）

补加去离子水至终体积为100μL

（2）94℃加热5min，使模板DNA完全变性，立即加入0.5μL Taq DNA聚合酶（4μg/μL～5μg/μL），充分混匀后，加入100μL轻型矿物油或液体石蜡将液面封闭，防止蒸发。

（3）按下表程序，进行扩增。

循 环 变性（94℃） 复性（50℃） 引物延伸（72℃）

第一次循环 5 min 2 min 3 min

中间循环

（25次～30次） 1 min 2 min 3 min

最后一次循环 1 min 2 min 10 min

（4）取出部分扩增后的DNA进行电泳分析，确定DNA的量及纯度。

（5）为去除油或液体石蜡的污染，需对样品进行重新提取。