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词条 PCR扩增仪
释义

基本概念

聚合酶链锁反应,Polymerase chain reaction,简称PCR,是一种分子生物学技术,用于扩增特定的DNA片段,这种方法可在生物体外进行,不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。PCR这项技术,被广泛地运用在医学和生物学的实验室,例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制,以及亲子鉴定。

历史发展

PCR这项技术是由凯利·穆利斯(Kary Mullis)发明,并因此在七年之后,1993年10月,获得了诺贝尔化学奖该项殊荣。穆利斯的想法是,利用一种人工方法,和反复相同程序的方法,并利用一种特殊的酶——即DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。

DNA聚合酶天然存在于生物体内,在细胞分裂前进行DNA的复制。当DNA开始复制时,解旋酶将双股的DNA分开成两个单股。DNA聚合酶便结合在两DNA单股链上,生成互补链。在穆利斯最初的PCR反应中,将DNA聚合酶用于体外试验。双链DNA被加热到96℃,使得双链分离成为两条单链。但是在这个温度下,DNA聚合酶被破坏,因此在每个循环的加热步骤后必须补充新的聚合酶。穆利斯的原始PCR反应效率极低,需要大量时间和DNA聚合酶,并且在整个PCR反应中都需要人来照看。

后来,由嗜热细菌水生栖热菌(Thermus aquaticus)体内产生的DNA聚合酶改善了这种低效的PCR反应。由于嗜热细菌生活在温度达到50至80 °C (122至176 °F)的间歇泉中,它的DNA聚合酶具有耐热性。在用于PCR反应时,高温并不能破坏这种DNA聚合酶,因此不需要不断加入新的聚合酶,PCR反应由此变得简单并且可以由机器操作。

最初的具有耐热性的DNA聚合酶来自于水生栖热菌(Thermus aquaticus),因此被称为Taq。Taq酶被广泛用于当前的PCR操作中。Taq酶的缺点是它缺少3'->5'校正外切酶活性,因此在复制DNA时有时会出错,造成DNA序列突变(错误)。从古菌中获得的Pwo酶及Pfu酶均有校正机制,能够大大降低PCR反应中的突变。将Taq与Pfu结合使用可以保证真实准确得扩增DNA。

操作过程

PCR用于扩增一小段已知的DNA片断,可能是单个基因,或者仅仅是某个基因的一部分。与活体生物不同的是,PCR只能复制很短的DNA片断,通常不超过10kbp。DNA是双链分子,因此用互补DNA双链的构造单位(核苷酸)来度量其大小,单位为碱基对(base pair, bp)。某些特定的方法可以扩增40kbp左右的片断,但是这种大小与真核细胞的染色体DNA相比仍然是很少的。例如,人的体细胞DNA含有大约30亿个碱基对。 目前应用的PCR反应需要几个基本组成:

DNA模板(template),含有需要扩增的DNA片断。

2个引物(primer),决定了需要扩增的起始和终止位置。(见下面引物一节)

DNA聚合酶(polymerase),复制需要扩增的区域。

脱氧单核苷酸(dNTP),用于构造新的互补链。

缓冲体系,提供适合聚合酶行使功能的化学环境。

PCR反应在热循环设备中进行。PCR仪可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确的温度。为防止反应体系中液体产生蒸气,通常在反应管上加盖加热的盖子(比加热板温度来的高),或者在反应体系表面加入一层石蜡油。

国内主要生产厂商排名

随着生物技术的发展,国内涌现出一批优秀的PCR扩增仪厂商:

1、天津金思德生物技术有限公司

2、上海山富科学仪器有限公司

3、赛唯斯科技(北京)有限公司

其中天津金思德生物技术有限公司是一家拥有自主PCR基因扩增仪产品品牌及相关分子生物学试剂研发、生产和经营的高新技术公司

天津金思德研发新PCR扩增仪技术参数

加热板模块 96孔(012-103)

模块材料 铝制合金材料

升降温速度 2.5℃/sec,2.2℃/sec

温度均一性 ≤±0.3℃

温度精确性 ≤±0.01℃

温度范围 4.0℃~99.9℃

梯度温差范围 0-40℃

循环数 可达两个嵌套循环,每个循环最多可有99个步骤

显示屏 7寸彩色触摸屏800×480

按键 单独的数字键0-9,字母键和功能键在触摸屏上

在线帮助系统 可靠的实时在线帮助

文件夹 4层文件夹,密码保护,用户权限管理

暂停功能 手工暂停

断电重启 恢复供电后可以继续执行断电时未结束的程序

热盖温度范围 25℃~99.9℃

热盖加热速率 ≥1℃/sec

热盖压力 最大压力120N

电压 85V~265V,50Hz~60Hz

步骤

一般的PCR反应由20到35个循环组成,每个循环包括以下3个步骤:

利用高温(93-98℃)使双链DNA分离(熔解)。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前,通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离,仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟。

在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上(降温或称接合)。此阶段的温度通常低于引子熔点5℃。错误的黏合温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。新技术的融合型核酸聚合酶在此阶段的温度会高于熔点3~5℃,仅需时间5~10秒。

最后,DNA聚合酶由降温时结合上的引子开始沿着DNA链合成互补链(延长)。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片断长度。传统的Taq估计合成1000bp大概需要1分钟、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、融合型聚合酶仅约15秒。

PCR的应用

基因图谱建立

亲子鉴定

侦测遗传疾病

克隆基因

基因突变研究

DNA遗传演化

基因表现比较

随便看

 

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更新时间:2025/2/19 8:54:18