词条 | PCR ELISA |
释义 | PCR自诞生以来,人们就在努力探索PCR定量的方法。荧光素染色凝胶电泳在PCR最初的一段时间是唯一的检测技术,因此人们在凝胶电泳的基础上使用扫描照片进行光密度分析,以求实现PCR的相对定量。 但是由于普通凝胶电泳检测本身的不特异性,只能进行粗略的相对定量,难以满足人们日益对精确定量的渴望,不过由于普通凝胶电泳光密度分析简捷易行,成本低,目前还是科研还很常用。但是难以满足临床应用的要求。 由于固相捕获技术的成熟和应用,特别是酶联免疫吸附试验(ELISA)的成功,给核酸定量提供了一个思路。此后,应用固相捕获的PCR定量技术应运而生。即在PCR扩增以后,在微也板上借用酶联免疫吸附试验(ELISA)的原理,使用酶标抗体,进行固相杂交来实现定量。被称为PCR-ELISA: PCR-ELISA原理: 首先,使用亲和素包被微孔板,再用生物素标记捕获探针3`端(捕获探针5`端和待检靶序列5`端的一段互补)通过生物素和亲和素的交联作用将捕获探针固定在微孔上,制成固相捕获系统。 其次,在扩增时,引物用抗原(生物素、地高辛、荧光素酶等)标记,这样扩增产物中就会代有抗原。 用扩增产物与微孔上的捕获探针杂交,靶序列被捕获。再在微孔中加入用辣根过氧化物酶标记的抗体,抗体与靶序列上的抗原结合,再加入底物使之显色。从而实现定量。 虽然PCR经过长时间的探索,PCR-ELISA逐渐成熟,并有了不同的改进版本,但总的还是没有脱离固相分离、酶标抗体的经典范畴。 PCR-ELISA的步骤: 1.核酸提取和制备 2.进行PCR扩增 3.微孔预杂交 4.产物杂交 5.显色 6.检测分析 PCR-ELISA的优点: PCR-ELISA相对于凝胶光密度定量,无论是灵敏度、特异性、准确度上都是很大的提高,能满足临床要求。它为PCR提供了第一个严格意义上的定量方法。并且对仪器要求较低。只要有扩增仪和酶标仪就可以进行。 PCR-ELISA的不足及消减措施: 1.污染问题严重。PCR-ELISA在扩增之后又要进行ELISA反应,而ELISA是一个开放性的反应,特别是洗板,很容易产生污染引起假阳性。为减小污染,一定要严格分区隔离,以避免污染。同时,使用dUTP与UNG酶也可以在一定程度上减小污染的影响。由于PCR产物都是高浓度的。一般情况下,产物都被扩增至2的20方以上,即使避免了扩增前的污染,但同批样本产物之间的交叉污染可能远远大于ELISA,不能忽视。 2.显色定量分析相对于最近的探针荧光分析,无论是灵敏度还是特异性上都有差距。 3.操作繁琐,这也是严重制约临床应用的重要因素。 注意:PCR-ELISA一定要严格分区,及时进行空间和仪器消毒,严防污染。 |
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