请输入您要查询的百科知识:

 

词条 蒽酮比色法
释义

蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应,反应后溶液呈蓝绿色,在620nm处有最大吸收。本法多用于测定糖原的含量,也可用于测定葡萄糖的含量。

蒽酮比色法测糖试验

一 实验目的 掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法

二 实验原理 蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖 基及已糖醛酸起反应,反应后溶液呈蓝绿色,在620nm处有最大吸收。

三 实验器材及试剂

马铃薯干粉

可调试移液器或移液管

可见分光光度计(723型)

电子分析天平

水浴锅

电炉子

蒽酮试剂:取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中,以80%H2SO4定容到1000ml,当日配制使用。

标准葡萄糖溶液(0.1mg/ml):100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中,定容到1000ml备用。

四、操作

1.制作标准曲线

取7支干燥洁净的试管,按表1顺序加入试剂,进行测定。

以吸光度值为纵坐标,各标准溶液浓度(mg/ml )为横坐标作图得标准曲线。

表1 蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作

沸水浴中准确煮沸10min,取出用流水冷却,室温放10min,于620nm处比色

葡萄糖浓度(mg/ml)

2.样品含量的测定

样品液的制作:

精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min(不时摇动)—→取出,

3000rpm离心10min(或过滤)—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形瓶中—→再从中取出1ml,再定容到10ml的容量瓶中

样品液的测定:

(1)取4支试管,按照表2加样(加蒽酮时需要冰水浴5min冷却)

表2 蒽酮比色法定糖——样品的测定

(2)加样冷却完成后置沸水中煮沸10min,取出流水冷却放置10min,620nm处比色测量各管OD值。

(3)以1号试管作为调零管,2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。

3.结果计算:

C×V

w = ————×100%

m,

式中w:糖的质量分数(%)

C:从标准曲线中查出的糖质量分数(mg/ml)

V:样品稀释后的体积(ml)

m:样品的质量(ml)

原理

植物在个体发育的各个时期,代谢活动也发生相应的变化,碳水化合物的代谢也不例外,其含量也随之发生变化。了解可溶性糖含量的变化,在生理上和实践上都有重要的意义。这里介绍的是蒽酮比色法,糖在硫酸的作用下生成糖醛,糖醛再与蒽酮作用,形成一种绿色的络合物,颜色的深浅与糖含量有关。方法简便,但没有志一性,对于绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮反应,产生颜色。

仪器药品

721型分光光度计 分析天平

研钵 恒温水浴锅

烧杯 容量瓶

三角烧瓶 大试管

移液管 漏斗

乙醚 草酸钠

饱和醋酸铅

葡萄糖标准溶液:称取已在80℃烘箱中烘至恒重的葡萄糖100mg,配制成500ml溶液,即得每ml含糖为200μg的标准溶液。

蒽酮试剂:称取1g经过纯化的蒽酮,溶解于1000ml稀硫酸中即得。硫酸溶液由760ml浓硫酸(比重1.84)稀释成1000ml而成。

操作步骤

1.可溶性糖的提取

称取重约5g的新鲜植物叶子,于研钵中乙醚少许,仔细研磨成均匀的浆状物,倒入烧杯中,用70℃热水洗涤研钵,洗液并入烧杯中,再加蒸镏水30─40ml。将烧杯放在水浴锅中加热,保持温度70─80℃约半小时,冷却后1滴1滴地加入饱和中性醋酸铅,以除去蛋白质,直至加入醋酸铅时不再形成白色沉淀为止。然后将此混合物连同残渣一并洗入100ml容量瓶中,加水至刻度,充分振荡。以干燥漏斗将滤液过滤于一干燥的三角烧瓶中,瓶中事先放有少量(约0.2─0.4g)草酸钠粉末,以除去滤液中过量的醋酸铅,使生成草酸铅沉淀,再行过滤,所得的透明滤液即为可溶性糖提取液。

2.显色及比色

吸取上述糖提取液1ml,放入一干洁的试管中,加蒽酮试剂5ml混合之,于沸水浴中煮沸10分钟,取出冷却,然后于分光光度计上进行测定,波长为625nm,测得吸光度。从标准曲线上查得滤液中的糖含量(或经直线回归公式计算),然后再行计算样品中含糖百分数。

3.绘制标准曲线

取标准葡萄糖溶液将其释成一系列不同浓度的溶液,浓度分别为每ml含糖0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg。按上述方法分别测得其吸光度,然后绘制A026-糖浓度曲线,或进行直线回归求得直线方程。

4.计算样品中含糖百分数(% )

设V为植物样品稀释后的体积(ml)

C为提取液的含糖量(μg/ml)

W为植物组织鲜重(g)

则得计算式如下: %=C×V/(W×1000000)×100%

蒽酮比色法测定多糖含量

[a]多糖含有几百个或更多残基,但只有一个还原基团,因此它的还原能力极弱,对于他们的测定,应先将它们用酸水解成单糖组分。

蒽酮比色法是一种快速而简便的定糖方法,糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物,该衍生物与蒽酮发生反应,反应后溶液呈蓝绿色,于620nm处有最大吸收。因此可用此方法测定多糖含量。

[b]试剂

2g/L蒽酮试剂:溶解2g蒽酮于1L浓硫酸(98%的浓硫酸)中,当日配制使用。

0.01g/L葡萄糖溶液(可加几滴甲苯作防腐剂)

0.1g/L糖元溶液

[c]实验器材

试管及试管架 吸量管(1ml,5ml) 恒温水浴箱(100℃) 制冰机 紫外分光光度计 滴管 白瓷板

制作标准曲线

准确称取0.1g葡萄糖(分析纯),溶解并用蒸馏水定容至100ml后,分别取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分别加入到50的容量瓶中,并用蒸馏水定容到50ml,配成浓度分别为20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml于试管中,再加入3ml的蒽酮试剂,迅速浸入冰水中冷却,待几支试管均匀加完后,一起浸入100℃恒温水浴箱中,为防止水分蒸发,应在试管口上加盖一个玻璃球或者加一个塞子,自温度重新升至100℃起计时,准确保温10min后取出,用流动水冷却,然后,于室温中平衡片刻(约10min左右),在分光光度计上,波长620nm处,用0.5cm厚度的比色杯,以空白管做对照空白(此处的空白是指不加葡萄糖的蒽酮试剂,其他反应条件都一致),进行比色。

既得标准曲线。

如下表格

编号 1 2 3 4 5 6

体积ml 1(蒸馏水) 1 1 1 1 1

浓度ug/ml 0 20 40 60 80 100

[d]样品测定

如上述条件一致,但要记得用除去蛋白质的样品溶液进行测定,否则会影响测定结果。

样品含糖量计算:

C×V2×D

样品含糖量(%)=----------------------×100%

W×V1×10

其中C----在标准曲线上查出的糖含量(ug),

V2---提取液总体积(ml)

V1---测定时取用体积(ml)

D-----稀释倍数

W-----样品重量(g)

10-----样品重量单位g换算成ug的倍数

注意事项:

1.一定要注意温度要控制在100℃

2.从100℃开始准确计时10min,然后迅速冷却,于室温中平衡10min.

3.蒽酮要注意避光保存。配置好的蒽酮试剂也应注意避光,当天配制好的当天使用。

4.试管要保证干燥清洁,无残留水滴。

随便看

 

百科全书收录4421916条中文百科知识,基本涵盖了大多数领域的百科知识,是一部内容开放、自由的电子版百科全书。

 

Copyright © 2004-2023 Cnenc.net All Rights Reserved
更新时间:2024/12/24 8:07:08