概念：

杂交瘤抗体技术

杂交瘤细胞的制备(实验方法： ELISA法操作步骤)

概念：

杂交瘤细胞是在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B细胞融合而成的细胞。

杂交瘤抗体技术

杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠细胞作小鼠骨髓瘤细胞。脾淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有b细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆，这种杂种细胞叫做杂交瘤细胞。

杂交瘤细胞的制备

阳性杂交瘤细胞的制备 1） 瘤细胞培养（无特殊要求） 骨髓瘤细胞呈悬浮或轻微附着形式生长， 如附着性生长的细胞多时， 用吸管轻轻吹打或轻轻 叩击培养容器即可分离下来。 通常要维持细胞于指数生长期 （细胞培养时间为 15~20 小时） ， 5 6 每 3~5 天取细胞 0.2~1ml 移入到 10ml 新培养液中， 其最大细胞密度不能超过 5×10 ~10 /ml。 一般使用含有高糖的 DMEM 培养液，并补加有 pH 的稳定剂 HEPES。 2）免疫小鼠和脾细胞的制备 ） 免疫：取 6~8 周龄 Balb/C 雌鼠，基础免疫 2 周，静脉再加强免疫一次，3~5 天后用于融合。 脾细胞制备： 1．引颈处死小鼠，用酒精消毒表体。 2．无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用 5ml 无血清培养液冲洗一次。 3．把脾脏置于已消毒的 90~100 目不锈钢网或尼龙纱网中。 4．在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通 过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入 3 ml 无血清培养液，反复抽吸数次方 法获取细胞，再制成细胞悬液亦可。 5．把细胞悬液注入 50ml 离心管中，加 10~20ml 培养液，轻轻吹打数次，室温中置 5 分钟。 6．离心（800~1000 转/分）计数，备用。 3）饲细胞的制备：常用小鼠胸腺细胞或小鼠的腹腔细胞 ）饲细胞的制备： 小鼠腹腔细胞制备方法： 1．引颈处死小鼠，用酒精消毒表体。 2．切开腹部皮肤剥向两侧，暴露出腹壁。 3．用无菌 7 号针头注射器，吸取 3ml 无血清培养液。 4．用小镊夹起腹壁，注入 3ml 无血清培养液，用手反复轻轻揉腹壁，再反复抽吸 3~5 次。 5．收集末次吸得的细胞，注入 50ml 的离心管中，再加 20ml 无血清培养液，用吸管漂洗一 次。 6．离心，去上清，用含血清培养基调节细胞浓度为 2×105/ml，接种入培养板中，24 孔板 每孔加 0.1ml。 4）细胞融合 ） HAT 培养基的制备 [贮备液成分]100× 次黄嘌呤（Hypoxanthine: H） 胸腺嘧啶核苷（Thymidine: T） 氨基喋呤（Amiropterin: A） [HT 贮备液制备 贮备液制备] 1．称取 136.1 mg H，38.8 mg T。 2．依次溶解在 100ml 双蒸水中，H 难溶，可加温 50~80℃促溶。 3．用 0.22 微米滤膜滤过除菌，每瓶分装 2~5ml，-20℃冰箱贮存。 [A 贮备液制备 贮备液制备] 1．称取 17.6mg A 到 90ml 双蒸水中。 2．滴加 1M NaOH 溶液并不断摇动，直至完全溶解，再滴加等量 1M HCl 溶液，恢复 pH 在 7.0 左右。 3．补足双蒸水至最终体积 100ml。 4．0.22 微米滤膜滤过除菌，分装，-20℃冰箱贮存。使用时，每 100ml 培养液（含血清）加 1ml HT 贮备液和 1ml A 贮备液。 1.0×10-2 M 1.6×10-3 M 4.0×10-5 M PEG（诱导剂）的制备（30%~50%） （诱导剂）的制备（ ） 1．取分子量 1000 的 PEG 高压蒸气灭菌（6.8 公斤，15 分钟） 2．56℃水浴中融化后，37℃水浴中温浴。 3．取无血清培养液 37℃水浴中温浴（单独） 4．配 40%浓度时，用刻度吸管吸 0.4ml PEG 和 0.6ml 无血清培养液混合、37℃水中温育备 用。 细胞准备 1．收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗 3 次（37℃） ，计数活力细胞（不少于 90%） 。 2．收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗 3 次（37℃） ，并计细胞数和测定活力细胞。 3．按 1：5 或 1：10 混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上 清。 融合 方法一： 1．将 1ml 40%的 PEG 液一滴滴加入到细胞团中，在 60 秒内加完，同时并不断轻微转动离 心管或用手指轻弹离心管。 2．在不断转动离心管中加 1ml 无血清培养液，60 秒钟内加完。 3．于 5 分钟内慢慢加完 20ml 无血清培养基。此时细胞对机械损伤非常敏感。 4．离心（800 转/分，8 分钟） ，去上清，用完全培养液 10ml 悬浮，轻轻混匀。 5．取 96 孔板，每孔加 50 微升。 6．取等体积细胞悬液，向另一 96 孔板中加 50 微升。 7．送入 5%CO2 温箱中 37℃培养，24 小时后更换成 HAT 选择性培养液。 方法二： 1．加 0.2ml 43%的 PEG 于离心管中。 2．用预先消毒的细玻璃针伸入管中轻轻搅动细胞团。 3．室温中置 2 分钟。 4．加入 10ml 完全培养液。 5．800 转/分离心 5 分钟。 6． 2 倍 HAT 培养液培养悬浮细胞， 24 孔板， 用 取 每孔中加 0.5ml， 96 孔板每孔中加 0.1ml。 另 7．5%CO2 温箱，37℃，一周后第一次更换培养液，培养板中预先接种有饲养细胞，加 2× HAT 选择培养液与原等量培养液混合后，即成为 1×的 HAT 培养基。 融合后细胞培养 1．融合后 7~10 天用 HAT 培养液变量换液，以后每隔 2~3 天半量换液一次。 2．两周后可改用 HT 培养液半量换液，或仍用 HAT 培养液。 3．2~3 周后出现杂交细胞集落，细胞个大，圆且透明。 4．待集落增殖生长至 1/3 孔时，应进行抗体检测。 克隆化培养 [软琼脂培养] 1．称 1g 琼脂粉，加入到 100ml 双蒸水中，高压蒸气灭菌，4℃冰箱保存。 2．使用前，1%的琼脂和 2×的 DMEM 培养液在 45℃水浴中分别温浴。 3．二者等体积混合后，立即加入 1.5×107 小鼠脾细胞，混匀。 4．立即到入平皿中，每平皿（直径 10cm）加 10ml，室温中置 15 分钟。 5．另取杂交瘤细胞悬液和 0.5%琼脂等体积混合（0.25%琼脂） ，加 2ml 到预先铺有底层琼脂 的瓶皿内。 6．CO2 温箱培养。 7．10~15 天后，有细胞集落形成，适时移入 24 孔培养板中扩大培养。如用琼脂糖，底层浓 度为 0.6%，上层为 0.3%琼脂。 [有限稀释法] 1．制备有饲养细胞底层的细胞培养板。 2．收集细胞、计数阳性培养细胞。 3．细胞悬液调至 5~10 个细胞/ml。 4．96 孔板中每孔加 0.1ml。 5．CO2 温箱培养一周后，半量换液，继续培养。 6．适时检测每孔培养上清，挑选呈阳性培养孔的细胞继续进行有限稀释，直至确信孔中细 胞为单克隆为止。 7．进行扩大培养。 5）抗体的检测 ） 常用方法：免疫荧光试验、放射免疫试验（RIA） ，酶联免疫吸附试验（ELISA）等。 胞的筛选

实验方法：

ELISA法。首次检测时间在细胞融合后10天左右进行。

ELISA法所需试剂配置

包被缓冲液(pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):

Na2CO3 1.59g

NaHCO3　2.93g

加蒸馏水至 1000ml

洗涤缓冲液(pH7.4 0.15M PBS):

KH2PO4 0.2g

Na2HPO4·12H2O　2.9g

NaCl　8.0g

KCl　0.2g

Tween-20　0.05%　0.5ml

加蒸馏水至 1000ml

ELISA法操作步骤

包被抗原：pH9.6碳酸盐缓冲液（CBS）稀释抗原，加入到酶标板中，100μL/孔，37℃ 2小时或4℃过夜。甩干，洗涤3次，3分钟/次。

封闭（血清或脱脂奶粉）：此步有时用，有时不用。

加被检样品（一抗），100μL/孔，37℃ 半小时，甩干，洗涤3次，3分钟/次。

加酶标抗体（二抗），100μL/孔，37℃ 半小时，甩干，洗涤3次，3分钟/次。

显色： 5ml的显色A液,5ml的显色B液，100μL/孔，37 ℃反应10～20分钟。

终止反应：加2M H2SO4，50μL/孔。

结果判定。肉眼或用酶标仪在450nm波长下测定OD值。

本实验室目前采用洗板机进行洗涤。