腺相关病毒 Adeno-associated virus(AAV)是一个常见的人细小病毒，自然缺陷、无包被和无致病原性。AAV复制周期由两个明显的阶段构成：潜伏期和增殖期。

腺相关病毒

病毒结构

复制过程

免疫及预防

腺相关病毒

在缺少辅助病毒诸如腺病毒(Berns,1990;Muzyczka,1992;Berns和Giraud,1996)、疱疹病毒、牛痘病毒或者在基因毒条件下(Yakobson等,1989),AAV能复制产生子代病毒颗粒。在缺少辅助病毒的情况下，腺相关病毒整合其基因组到19号染色体的一个特别位点并保持整合直到随后的辅助病毒将其从潜伏状态下拯救出来(Kotin等，1990)。AAV的位点特异性的整合能力、其自然缺陷以及其无致病原性使其成为基因治疗载体成为可能。重组AAV(rAAV)载体能转导培养细胞以及体内不同组织比如肺(Flotte等,1993;Conrad等,1996;Halbert等,1997)、脑（Kaplitt等,1994）、肌肉(Xiao等,1996)、视网膜（Ali,1996;Flannery等1997）、中枢神经系统(Peel等,1997)和肝(Xiao等,1998)。

病毒结构

AAV基因组是一个线性、单链(ssDNA)分子，4680个核苷酸，在每个末端含有一个145个碱基末端重复序列(TR)（Srivastava等,1983）。TR序列折叠成发卡结构作为DNA复制起始和包装重组AAV基因组为感染性的病毒颗粒所需的唯一已知顺式作用元件。TR元件位于两个翻译开放阅读框(ORF)的两侧。左侧ORF(或rep基因)编码四个非结构蛋白质称为Rep78、68、52和40，对于病毒DNA复制和包装是关键性的。右侧的ORF(或cap基因)编码三个结构蛋白质VP1、VP2和VP3(Berns,1990;Muzyczka,1992;Berns和Giraud,1996)。

重组腺病毒载体(rAAV)的构建通常涉及rep和cap基因的剔除和将感兴趣的转基因插入TR元件之间。产生的载体质粒随后与一个表达AAV的rep和cap基因的包装质粒一起共转染到组织培养细胞中。质粒转染的组织培养细胞被感染Ad以提供辅助功能以有效复制AAV和基因表达。几天后收获培养物，并利用柱层析或多轮超速离心纯化rAAV。60°C加热灭活任何残留的Ad。关键的Ad辅助基因包括：E1a转录激活Ad以及AAV基因，E1b和E4编码增进mRNA装运到细胞质的蛋白质，E2a表达一个ssDNA结合蛋白质促进AAV

复制过程

DNA复制，VAI RNA基因生成一个小RNA转录物增进AAV capsid mRNA的翻译。

此繁琐过程的局限性阻止了rAAV广泛发展为基因治疗的载体。如上所述载体的生成总是导致载体的明显Ad污染，因此需要热处理和严格的纯化方法灭活和去除Ad病毒颗粒污染。尽管载体和包装质粒之间通常没有同源序列，但是经常产生野生型样有复制能力的AAV(rcAAV)(Allen等，1997；Wang等，1998)。已经进行了许多尝试改进rAAV载体的包装效率。它们包括：发展表达一些或所有包装所需的AAV基因的细胞系（Yang等,1994;Clark等,1995;Tamayose等,1996;Inoue和Russell,198），构建Ad辅助质粒能够用来替代Ad感染(Matsu***a等,1998;Xiao等，1998b)和发展重组Ad携带rAAV载体基因组(Gao等,1998)。

免疫及预防

我们已经构建了新的辅助质粒，完全不用在rAAV包装过程中感染Ad。这些质粒含有Ad基因组的VA、E2a和E4基因以及AAV的rep和cap基因。当转染到含有Ad5E1a和E1b基因的人293细胞中，辅助质粒提供了一个有效的、无Ad污染的包装系统。我们用此新系统所产生的rAAV滴度与大多pAAV/Ad包装质粒(Samulski等,1989)相比提高了80倍。另外，Ad再也不能产生，有复制能力的AAV在任何载体制备过程中尚未发现。