小立碗藓（Physcomitrella patens）在分类上属于葫芦藓科，小立碗藓属，分布于欧洲、亚洲、非洲及大洋洲，我国湖南省张家界地区有分布。小立碗藓是一种非常理想的植物分子生物学研究材料。

小立碗藓概述

特征特性

小立碗藓成长史

分子生物学特点

小立碗藓的培养

小立碗藓概述

它生长所需营养简单，容易培养；其配子体在生活史中占优势，对其突变体的表型可以进行直接研究；其核基因组易于与有同源片段的外源DNA发生高频率的同源重组，从而使得精确的基因破坏和基因敲除成为可能，为基因功能的研究提供了良好的材料。小立碗藓与高等陆生植物有很多相似特点，而小立碗藓的一些特性使得它比其他植物更易于进行分子生物学的研究。小立碗藓在国外已经成为植物分子生物学研究的模式生物。

特征特性

小立碗藓植物体矮小，黄绿色，有光泽，稀疏丛集。其茎细而短。叶片呈卵形或披针形，茎基部的叶较小，中肋单一、细长。蒴柄短粗，孢蒴呈圆球形或梨形，对称、不伸出叶丛，无蒴盖分化，孢蒴成熟后不规则开裂，蒴齿缺如，蒴帽极小，呈钟形。成熟后基部四瓣浅裂。孢子呈球状肾型。

小立碗藓成长史

在小立碗藓的生活史中，配子体世代占优势，孢子体细胞经减数分裂形成孢子，孢子萌发形成原丝体。原丝体是由顶端细胞经一系列分裂形成的绿丝体细胞组成的，绿丝体细胞含有大量叶绿体，顶端细胞的分裂周期大约为24 h。绿丝体的次顶端细胞经过有限次数的分裂形成侧枝。顶端细胞经过转变，继续分裂形成轴丝体。轴丝体是另外一种原丝体，其细胞内容物较少，叶绿体数量较少。像绿丝体一样，轴丝体的延伸也需要顶端细胞的不断分裂，但其顶端细胞的分裂周期只有6 h。而且，其线性延伸的速度也很快，可达40 mm/h，而绿丝体只有2 mm/h。这使得它可以在土壤或琼脂中快速生长。轴丝体的次顶端细胞进行有限次数的分裂形成侧枝。很多侧枝在强光条件下发育成绿丝体，其他发育成轴丝体和芽。芽的发生是植物生长从二维原丝体生长转变成三维的植物体生长的转化过程。芽产生配子和配子囊，小立碗藓为雌雄同株，但雌雄生殖器官即颈卵器和精子器分别在不同的枝上。精子器成熟后顶端裂开，精子溢出体外，借助水游到颈卵器附近，进入颈卵器，与卵接合，形成合子，合子不经休眠，即在颈卵器内发育成胚。胚逐渐分化形成蒴柄和孢蒴。蒴柄深入母体形成基足，基足吸收养料，蒴柄上长有孢蒴，小立碗藓孢蒴的结构比其他苔藓植物简单，没有帮助孢子释放的结构。每个孢蒴中大约产生4 000个孢子。小立碗藓在培养条件下，大约8周完成一次生活史。小立碗藓几乎所有的细胞，不管是孢子体的还是配子体的，都可以再生为原生组织。孢子体产生的原生组织可再生为配子体，这说明孢子体与配子体表型上的差异并不是由核型产生的。 原生质体很容易从幼嫩的原生组织中分离获得，在没有激素的介质中，原生质体也能长得很快。原生质体可直接形成绿丝体，这个过程类似于孢子发育过程。

分子生物学特点

小立碗藓有27条染色体相对于其他苔藓植物较多一些。利用流式细胞仪分析得到的小立碗藓核基因组大约为511 Mb，比一般开花植物的基因组低。Southern杂交表明：小立碗藓基因组中至少含有一个高度重复序列的基因家族。温度变性试验表明：基因组中G+C含量为34.6%。小立碗藓的基因组与其有同源序列的外源DNA片段易于发生同源重组。在某个小立碗藓的转基因品系中，用相同的质粒对其进行再次转化，结果发现，原来转入的基因发生沉默，基因分析表明: 第二次质粒的插入位点在第一次获得该转基因品系的质粒的插入位点上或在其附近。这表明在第二次转化过程中转入的质粒与重组品系的基因组之间发生了同源重组。这就使基因打靶技术在小立碗藓中成为可能。对高等陆生植物进行转基因，含有同源序列的质粒与基因组发生同源重组的几率很小，只有0.01%~0.1%。而在小立碗藓中，同源重组率就大得多。而同源重组可以让植物分子生物学家们通过敲除目标基因来研究不同基因的功能。

小立碗藓的培养

小立碗藓生长所需营养较简单，容易培养。可以用水培或用只含无机盐的培养基培养。通常情况下，用铺有琼脂的培养皿或盛有水的锥形瓶培养即可。小立碗在发酵罐中悬浮培养的小立碗藓再生能力强，从配子体取下的任何组织都可以继续培养，而新生的原生组织生长最快。

一个得到原生组织的简单方法是将原生组织匀浆并接种于新鲜琼脂培养基上。在上面覆盖一层玻璃纸可以减缓组织的生长速度，简化最终得到的组织。一周后，培养得到的组织大部分由绿丝体细胞组成，是获得原生质体良好材料。一个标准培养皿（直径90 mm）接种一周可得到干重50 mg的组织（25℃,白光）。用纤维素酶消化可以得到5×10 6个原生质体。小立碗藓在22-27℃的环境中，生长最迅速，15℃时生长缓慢，但这个温度可以诱导配子体产生。植物体在连续光照条件下生长良好，16 h光照、8 h黑暗的周期处理可以诱导原丝体组织的分化。

培养小立碗藓的原生质体可以利用半连续式光合自养生物反应器，使用这种方法不但可以获得用于转化的大量原生质体，并且可以利用小立碗藓的原生质体生产蛋白。利用添加2.5 mmol/L酒石酸铵的Knop培养液，通入含2%CO2的空气，pH值控制在4.5-7.0，可得到最大比生长速率为0.57/d。利用5 L的生物反应器每天可得到1 100 mL的悬浮培养物，稀释率为22%。在培养基中添加一些微量元素和一些辅酶、维生素等可以提高原生质体培养的最大成活率。

得到的小立碗藓突变体可以保存在液氮里, 但是其组织在冷冻和解冻过程中可能死亡，如果不进行继代培养，将组织密封于培养皿中，置于15℃条件下，则至少可保持一年。