透明颤菌是一种专性好氧的革兰氏阴性丝状菌，属于贝日阿托氏菌属（Beggiatoe），在沼泽、腐烂植物等贫氧的环境中生长旺盛。透明颤菌血红蛋白使细菌在低氧条件下能够很好生存的生理功能尚不完全清楚，各国科学家对vgb基因进行了细胞定位、表达调控以及该血红蛋白对能量代谢和呼吸链影响等多方面的研究。

简介(专性好氧的革兰氏阴性丝状菌 同型二聚体)

VHb基因的克隆、表达与调控(各方观点 实验)

VHb的生理功能(易化扩散假说和氧化还原效应假说 末端电子受体假说 比较与总结)

简介

专性好氧的革兰氏阴性丝状菌

透明颤菌是一种专性好氧的革兰氏阴性丝状菌，属于贝日阿托氏菌属（Beggiatoe），在沼泽、腐烂植物等贫氧的环境中生长旺盛。VHb在透明颤菌中被发现，最初被认为是“细胞色素o(cytochrome o, Cyo)”蛋白，具有末端氧化酶的性质。Cyo在不同的环境条件下可呈现三种不同的状态，即氧化态、还原态、氧合态，并可以相互转化；其中还原态是生理活性态，而氧合态则是富氧条件下的表现形式。它在577、544和420 nm处有最大吸收峰，若向溶液中鼓入CO气体，则可形成蛋白?CO复合物，在566、535及419 nm处呈现特征吸收峰。但是随着1983年真正的Cyo的分离和确定，实验表明该蛋白在光谱学和氧结合动力学性质上与氧合肌红、血红蛋白相似。1986年，Wakabayashi等结合蛋白质初级结构、光谱性质、氧结合动力学确定了该蛋白的结构，并将该蛋白正式命名为透明颤菌血红蛋白。

同型二聚体

VHb为同型二聚体，带有两个相对分子量为15 775的亚基，每个亚基含有146个氨基酸残基和两个b型血红素。完整的VHb是可溶性的，但是脱去血红素辅基便不可溶。序列分析表明，VHb与其它真核生物蛋白氨基酸有明显的同源性，其中与黄羽扇豆血红蛋白（Yellow lupin LegHb）的同源性最高，达到24%。真核生物的血红蛋白形成8个α螺旋区（A、B、C、D、E、F、G和H），而VHb每个亚基形成6个α螺旋区（A、B、E、F、G和H）。X射线晶体学表明VHb在近端和远端有独特的血红素端囊，初步认为受E螺旋和F螺旋的干扰所致，通过氢键和TyrB10、GlnE7、ProE8及LysE11四个残基形成此结构。大多数种类的血红蛋白都有一个末端的His(E7)残基，该His残基通常通过氢键与氧结合。而VHb端囊的E7位置为Gln残基。定点突变表明，GlnE7 His突变对VHb立体结构影响很大，野生型VHb解离常数比GlnE7 His突变型蛋白大很多，因此，VHb与被束缚的氧亲和力小，从而使氧的传递速度更快，这与晶体学研究结果一致。而在N端存在某些结构差异，少了α?螺旋，这段序列曾被认为可能是前导肽，影响VHb的分布，使活性VHb主要分布在细胞周质。近期用电子显微镜对VHb在透明颤菌和大肠杆菌中分布的分析结果表明，VHb主要分布在细胞质中而不是细胞周质，作者还认为细胞周质中的VHb可能是VHb过量表达而被挤出的结果。

VHb基因的克隆、表达与调控

各方观点

20世纪80年代中期以前，学者们一直认为，可溶性Cyo在细胞呼吸中作为一种终端氧化酶而起作用。1986年，Orii等对VHb与O2及VHb与CO结合的动力学进行了讨论，指出VHb可能是作为O2载体和储存物而起作用的。1988年，Dikshit等根据已报道的VHb氨基酸序列合成探针，与透明颤菌基因组DNA进行杂交，在透明颤菌血红蛋白基因（Vitreoscilla hemoglobin gene, vgb）可能位区，得到了含有vgb基因的1.4 kb的DNA片段，且此vgb基因携带内启动子而不受载体启动子的控制；同年，Khosla等也用类似方法克隆了vgb基因，在vgb重组大肠杆菌中表达时，同样得出了vgb基因是以自身启动子启动表达的结论。他们还测定了vgb基因的核苷酸序列，结果与Wakabayashi报道的VHb氨基酸序列十分吻合。

实验

将vgb基因转入大肠杆菌中表达，VHb的量与环境中的氧含量有关，vgb基因启动子在微氧条件下（小于2%大气饱和度）被诱导。将vgb基因启动子与氯霉素乙酰转移酶和儿茶酚双加氧酶等报告基因融合并转入大肠杆菌中表达，发现在低氧条件（5%）下的报告基因产物比高氧条件（20%）下多5～7倍，说明vgb基因启动子的活性受氧浓度的调控。当去掉启动子的vgb基因和大肠杆菌tac启动子融合后，其表达不再受氧调控而异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside,IPTG)可以增加表达。vgb基因在大肠杆菌和透明颤菌中表达条件相似，都随溶氧水平下降而表达水平升高。光谱分析表明，重组大肠杆菌表达的VHb的存在状态与透明颤菌中表达的VHb的存在状态相一致：在富氧条件下呈氧合态，而缺氧条件下呈现生理活性的还原态。溶氧并非直接作用于vgb基因启动子上，而是由铁氧还蛋白?NADP还原酶（ferredoxin?NADP reductase, FNR)或环腺苷酸受体蛋白质（cyclic AMP receptor protein,CRP)相关蛋白作为转录激活因子正向调控vgb基因表达。其中vgb基因启动子区域同大肠杆菌lac启动子CRP结合位点有极高的同源性。FNR蛋白是细菌应答厌氧环境的一个调控子，属于螺旋?转折?螺旋结构的DNA序列的结合蛋白，并且富含半胱氨酸，形成半胱氨酸口袋结构，能与Fe2+和Fe3+参与细胞对氧的应答。FNR调控系统是通过FNR蛋白在限氧条件下对厌氧基因的激活来应答环境信号的。在缺乏fnr的大肠杆菌突变体中，vgb启动子在贫氧条件表达产物减少了一半，这表明在调节vgb启动子活性中存在着FNR或FNR样蛋白质。另外Khosla等认为培养基中的氮源（例如酵母提取物）能抑制vgb启动子的表达，具体机制目前仍不清楚。

VHb的生理功能

目前，透明颤菌血红蛋白使细菌在低氧条件下能够很好生存的生理功能尚不完全清楚，各国科学家对vgb基因进行了细胞定位、表达调控以及该血红蛋白对能量代谢和呼吸链影响等多方面的研究。

易化扩散假说和氧化还原效应假说

Kallio等提出了两种假设：易化扩散假说和氧化还原效应假说。易化扩散假说认为VHb与氧结合增加了氧在细胞周质空间的传递量。Khosla和Bailey发现大肠杆菌中表达的VHb有35%～45%分布在周质空间。VHb蛋白N端功能域具有弱输送前导肽的功能，从而使VHb分布在细胞周质空间和细胞质内，支持了易化扩散假说。氧化还原效应假说认为氧合透明颤菌血红蛋白可能影响了细胞内一些关键的氧化还原敏感分子的活性，可能是呼吸链上的某个关键酶，该影响可引起能量代谢效率的提高。

末端电子受体假说

吴奕等提出了另一种假说即末端电子受体假说，认为氧合态VHb作为末端电子受体参与大肠杆菌呼吸链末端氧化过程，他们还依据这一假说定量研究了VHb对大肠杆菌能量代谢的影响。研究表明，VHb在微氧代谢状态时的表达大大提高了呼吸链末端电子受体量，促进电子传递过程转向能量代谢效率较高的Cyo途径，从而使细胞适应贫氧的生活环境。

VHb对生长的促进作用在有细胞色素o而无细胞色素d的突变体中比在有细胞色素d而无细胞色素o的突变体中更加显著。VHb增加了这两种末端氧化酶(尤其是细胞色素o)的含量并提高它们的活力。低氧条件下，VHb的存在使更多的葡萄糖转向磷酸戊糖途径代谢，而向三羧酸循环的碳源减少，总的ATP产量加大，而底物水平磷酸化产生的ATP减少。VHb还增加大肠杆菌吸收氧的速率，但细胞中的NAD(P)H含量减小。说明VHb提高了电子传递链的周转率。

比较与总结

VHb在大肠杆菌中的表达明显促进了微氧条件下细胞的生长状况和蛋白质合成的能力。Khosla等分析了VHb表达前后菌体蛋白的组成，蛋白质的种类没有改变；从产生效应的时间来看VHb的功能是由其本身所引起，而不是细胞在基因水平的二次应答。

尽管VHb的作用机制还需要进一步研究，但用光谱分析方法发现VHb蛋白可与氧结合成稳定的氧合态，氧合态的形成是VHb发挥生理功能的必需条件。多数证据显示，以这种氧合态的形式介入细胞与氧的代谢途径，最终影响某些基因的表达。