| 词条 | 亲和膜分离 |
| 释义 | 简介亲和膜分离又称膜亲和层析，是一种利用亲和配基修饰的膜（亲和膜）为介质的分离纯化生物大分子的技术，是膜分离技术和亲和层析技术的有机结合。其分离过程包括亲和吸附、洗脱、亲和膜再生等步骤。多采用错流方式，达到分离与浓缩之双重目的。该技术的关键是制备适宜的亲和膜。具有传质阻力小、达到吸附平衡的时间短、配基利用率高、设备体积小等优点。膜污染等导致吸附效率低、膜寿命下降是其主要问题。可实现生物大分子的高效、大规模分离纯化。如以A蛋白为配基的亲和膜全自动分离纯化系统可一步完成除菌、纯化和浓缩操作，用于纯化小鼠单抗的速度可达传统层析法的100倍。 工作原理亲和膜（affinity membrane）是利用亲和配基修饰的滤膜。亲和膜分离是以亲和膜为亲和吸附介质纯化目标产物的分离方法，是亲和色谱的变型，又称膜亲和色谱（membrane-based affinitychromatography）。 亲和膜分离过程如下： 改性基于在微孔滤膜或超滤膜上所具有的某些官能团，通过适当的化学反应途径，将其改性，接上一个间隔臂（Spacer），一般应是大于3个碳原子的化合物。 制备选用一个适合的亲和配基（Ligand），在一定条件下让其与间隔臂分子产生共价结合，生成带有亲和配基的膜分离介质。 亲和络合将样品混合物缓慢地通过膜，使样品中欲分离的物质与亲和配基产生特异性相互作用，产生络合，生成配基和配位物（Ligate）为一体的复合物（Complex），其余不和膜上配基产生亲和作用的物质则随流动相通过膜流走。 亲和作用是范德华力、疏水力、静电力、氢键、化学键等作用力的综合表现，亲和吸附时载体与配基之间主要遵循以下互补匹配原则：几何形状互补匹配；静电相互作用互补匹配；氢键相互作用互补匹配；疏水相互作用互补匹配。 下表列出了亲和载体与目标蛋白的可能结合形式及其原因： 结合形式 产生原因 离子间的相互作用 主要因氨基酸侧链的电荷引起静电作用 氢键结合 配体含O 或N 原子时, 与结合部位形成氢键 疏水性相互作用 配体与结合部位都含有非极性基团 对金属原子配位 目标分子与配体的一部分都与同一金属原子配位 弱共价键结合 如醛基和羟基间形成的弱共价键, 存在可逆性 洗脱改变条件，如洗脱液的组成、pH值、离子强度、温度等，使复合物产生解离，并将解离物收集起来，进一步处理。用亲和膜色谱法纯化生物大分子时，使用的缓冲液组成、pH值和离子强度，以及操作时的加料速度和温度、洗脱方式、洗脱液的组成和性质是影响产品纯度甚至成败的关键因素。尤其使用特异性比较低的配基时，要特别注意纯化条件和洗脱方式的选择。洗脱方式有特异性洗脱和非特异性洗脱。特异性洗脱就是在洗脱液中加入对配基有更强亲和力的物质，将目标蛋白质置换下来。而改变缓冲液中的盐浓度、pH值、温度、加入变性剂等则属于非特异性洗脱。 再生将解离后的亲和膜进行洗涤、再生、平衡，以备下次分离操作时再用。 制备流程亲和膜的制备方法主要有以下两种路径： （1）膜材料→成膜→活化→配基偶联，此法主要是利用现有的商品膜，通过对其进行偶联改性来获得所需要亲和膜； （2）膜材料→活化→配基偶联→成膜，此法从最简单的膜材料入手，先制备功能化的膜材料，再使之成膜。 配基配基是亲和膜分离技术的核心，是指能够与目标产物进行可逆的特异性结合的分子或基团，按其来源和作用对象分类见下表所示。 配基类别 配基种类 特点 备注 按来源分类 天然配基 凝集素、肝素、核苷酸、蛋白A、蛋白G等 性能优于人工合成配基，但制取和提纯较困难，价格昂贵且使用条件苛刻。 人工合成配基 活性染料、过渡金属离子、人工合成肽段、烷基等 按作用对象分类 特异性配基（生物特异性配基） 肝素——肝素酶； 通用性配基（基团特异性配基） NAD、NADP（辅酶）——脱氢酶； 间隔臂为了减小空间位阻，提高配基的有效使用率和利用率，通常需要在介质与配基间共价键合间隔臂，尤其当配基是小分子而纯化对象为大分子时。间隔臂一般都是双官能团化合物，例如二氨基二丙胺，二氨基己烷，氨基己酸，乙二胺，氨基酸，胺化环氧化物等。一般情况下可使用含六个碳原子的间隔臂如己二胺、6-氨基己酸等。间隔臂有疏水性间隔臂和亲水性间隔臂，如己二胺是疏水性的，而1,3-二氨基-2-丙醇、小肤、低聚甘氨酸、聚(L-赖氨酸)等是亲水性的。间隔臂的亲、疏水性将影响配基的亲和力大小及所合成介质的特异性。间隔臂过短起不到减小空间位阻的作用，而过长又可能通过弯曲封闭膜上的相邻的活性位。 载体在亲和膜分离技术中，分离膜即为配基和间隔臂的载体，其特异性是影响亲和吸附总效率的重要因素之一。理想的载体应具有高度特异性（表面电荷总量接近为零）、高度亲水性（无疏水作用位点）、足够多可利用的化学基团、适当的表面积和孔径、较高的理化稳定性等特点。一般情况下，决定亲和吸附总效率的主要因素是载体的特异性、吸附容量和稳定性，这三个因素的相对重要性依纯化的目的和规模不同而异。 随着高分子材料以及成型加工工艺学的不断发展，为亲和膜分离技术提供了许多不同形状、不同化学组成的膜组件，如平板膜、叠合平板膜和中空纤维膜。这些膜所用的基质主要分两大类：一类是天然高分子材料，如纤维素及其衍生物；另一类是人工合成高分子材料，如聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）、聚砜（PS）、聚丙烯睛（PAN）、聚乙烯醇（PVA）等。 配基的偶联为了制备亲和膜，配基应与膜材料进行共价结合。有许多活化方法及偶联技术可供使用，如：嗅化氰法（CNBr）、环氧法、高碘酸钠法、二乙烯砜法及2-氟-1- 甲基吡啶瓮-4-磺酸盐法（FMP）等，人们可以根据不同的膜材料选择一种较为合适的活化方法。 结构形式亲和膜按照形状可分为板式、圆盘式、中空纤维式，其中，前两者统称为平板亲和膜： ①平板亲和膜可将膜片堆叠起来制成膜柱或膜堆，具有上下均一、结构简单、成本低等优点，但存在填充密度小、放大时操作压将大等缺点。 ②中空纤维亲和膜可制成填充密度较大的膜堆，放大时也不存在压降大幅度变化的问题，便于实现连续、自动、规模化操作；但由于在膜管轴向和径向上存在流速分布，流速不同会导致亲和吸附不均匀。 实现膜上亲和分离需要解决的几个关键问题： （1）膜表面要有足够多并可利用的化学基团（一般为-OH，-NH2，-SH或-COOH基），使其能进行活化，接上合适的间隔臂和配基。 （2）要有足够数量可利用的化学基团则必需有足够高的表面积，要便于让生物大分子自由地出入膜，必需有足够大的孔径。 （3）孔分布应窄而均匀，以获得高的通透量和分离效能。 （4）为了实现快速分离，常要加压操作，因此要求膜有一定的机械强度，能承受一定的压力，长期使用不变形。 （5）亲和膜要耐酸、耐碱、耐高浓度的缓冲夜和有机溶剂。 技术特点膜分离过程设备简单，易于放大，成本低，分离速度快，可连续操作；而亲和分离的选择性和特异性较强。二者结合则兼具处理量大、选择性强、易于放大等显著优点。该技术不仅利用了生物分子的识别功能，可以分离低浓度的生物产品，而且由于膜的渗透通量大，因而能同时进行纯化和浓缩。 与亲和色谱相比，亲和膜色谱的最大优势在于其动力学方面，它克服了颗拉状多孔载体扩散传质阻力大的缺点，代之以对流传质，这样就可以在较低的操作压和较高的流速下对目标蛋白进行快速的分离和纯化，从而缩短操作时间、提高纯化效率。另外，对配基量相等的膜柱与树脂吸附柱，前者的生产速率远远大于后者，尤其是在高速进样条件下。 操作方式亲和膜分离过程的操作方式分为死端过滤和错流过滤，对平板膜和叠合平板膜多采用死端过滤，而对于中空纤维膜多采用错流过滤模式。 应用领域随着生命科学和生物工程的迅速发展，对生物大分子纯化分离的要求越来越高。对一些分子量相差很小的大分子就要用亲和戒指所具有的特异性将其分离出来。目前，亲和膜分离技术已应用于单抗、多抗、胰蛋白酶抑制剂的分离以及抗原、抗体、血清白蛋白、胰蛋白酶、干扰素等的纯化。 亲和膜分离技术的发展和成熟应用，极大地推动了热敏物质（蛋白质、酶、维生素、中草药等）和分子量相近物质（同分异构体、同系物等）分离技术的发展。 亲和膜分离技术在以下方面得到广泛应用： ① 蛋白质和酶的分离纯化； ② 手性拆分对映异构体；亲和膜中的配基可以选择性的吸附对映异构体中的某一种，而对另外的不具有吸附性，用适当截留分子量的亲和膜截留料液，实现对映异构体的分离，然后再用洗脱液将所需物质洗脱，从而得到分离纯化的产品。 ③ 测定单股核苷酸目标分子的碱基序列； ④ 测定转移酶活性。 |
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