western印迹

一、原理

二、分类

三、试剂

四、步骤

western印迹

也称Western免疫印迹（WesternBlot或WesternBlotting），是指将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移至到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，然后用抗体通过免疫学反应检测目的蛋白，分析基因的表达程度。

与之相对应，用标记的核酸探针杂交检测固定在固相载体上的DNA样品的方法称为Sorthern印迹杂交；检测RNA的方法称为Northern印迹杂交。

一、原理

固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、分类

western显色的方法主要有以下几种：

i.放射自显影

ii.底物化学发光ECL

iii.底物荧光ECF

iv.底物DAB呈色

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

三、试剂

1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。

3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。

4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris-CL。

5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.

6、SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.80.5mol/LTris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。

8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。

9、丽春红染液储存液：丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。

10、脱脂奶粉5%(w/v)。

11、NaN30.02%叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。

13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。

14、过氧化物酶标记的第二抗体。

15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。

16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。

17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。

18、100mmol/LNaCl。

19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/LEDTA。

四、步骤

互联网上几乎可以搜集到所有WesternBlot的中英文资料，仅供实验参考，可以根据自己实验的实际情况进行调整。 这里提供一种：

1）按厂商的使用指南用两块干净的玻璃，平板和0.75mm垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。

2）按表7.1配制分离胶液体并脱气，然后加入10%的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。

表7.1 聚丙烯酰胺分离胶的配制

试剂成分 配制不同浓度分离胶所需试剂(ml)

5% 8% 10% 12% 15%

Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50

4×Tris·Cl/SDS, pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75

H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75

10%过硫酸铵 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10%用于16～70kDa，15%用于12～45kDa。

3）用一根巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约5cm高为止。样品体积少于10μl不需灌制积层胶。

4）用另一根巴斯德吸管，先从一边的垫片，再从另一边垫片往夹层的液面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇（厚约1cm）。让凝胶在室温聚合30min。

聚合后，可见在顶层异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线，胶的聚合失败往往问题在于过硫酸按或TEMED，或两者都有。

5)倾去顶层的异丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面,尽量用吸水纸吸干。

6)按表7.2配制积层胶液体，用吸管将液体沿一条垫片加入到玻璃平板夹层，直至夹层的顶部。

表7.2 聚丙烯酰胺积层胶的配制

GEL%（3.9%) Total (10.05ml)

Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml

4×Tris·Cl/SDS, pH6.8 2.50 ml

H2O 6.10 ml

10%过硫酸铵 0.05 ml

TEMED 0.01 ml

7)将0.75mm厚的梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶液体充盈剩余空间。让积层胶室温聚合30min。

8)在具螺口盖的微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1:1(v/v)稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸5-10min。如样品是蛋白质沉淀物，加入50～100μl 1×SDS加样缓冲液溶解之，并同样在100℃煮沸5-10min。按供应商的使用指南用2×SDS加样缓冲液溶解蛋白质分子量标准混合物。

对于0.3cm宽的加样孔，推荐加样体积以不超过20μl 为宜。用考马斯亮蓝染色法显迹，成分很复杂的蛋白质混合物需加25～50μg，而样品中只有一种或不多的几种蛋白的话，只需1～10μg蛋白量。采用银染显迹时，样品用量可减小10～100倍（按样品的复杂程度在小于20μl的体积溶有0.01～0.5ng蛋白样品不等）。

2×SDS加样缓冲液(loading buffer)配制：

成　分 体积 (ml)

0.5M Tris·Cl (pH6.8) 12.5

20%SDS 11.5

Glycerin 10

2% Blue-Bromo-phenol 2.5

β-mercaptoethanol * 5.0

加H2O至总体积50 ml，分装

*β-mercaptoethanol 在临用前加入。

9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。取出梳子后，以1×SDS电泳电泳缓冲液冲洗加祥孔，并以此缓冲液充满之。

10）按厂商指南将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室（上槽），同时往下缓冲液室（下槽）加入推荐量的1×SDS电泳缓冲液。

11）将固定于上槽的凝胶板放入下槽中，并往上槽加入部分电泳缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔。

12）用带平嘴针头的50μl注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔中，小心加样使样品在孔的底部成一薄层，对照孔加入蛋白质分子量标准样品，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。

13)再往上槽加入余下的1×SDS电泳缓冲液。此操作缓慢小心，以防冲起样品孔中的样品。

14）连接电源，对于0.75mm厚的垂直板电泳，先在60V下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。

15）关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。连同上槽一起将凝胶夹层取出。

16）将凝胶定位以便识别加样的顺序，将凝胶板从上槽解离出来，放在一叠吸水纸或纸巾上。

17）小心将封边的垫片抽出一半，并以此为杠杆橇起上面的玻璃平板，使凝胶暴露出来。

18）小心从下面的玻璃平板上移出凝胶，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序，接着就可进行蛋白质的检测。

19)转膜

将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。（100V，1小时）要放于4℃。英文

1. For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).

2. For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent (250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).

3. For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).

4. For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).

Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4?. Please follow the manufacturer1s recommendations

20)、清洗

将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。摇床摇动。（这步忘了！）

21)、封闭

1. Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20).

2. Incubate the blot for 1 hour at 37℃, 2 hours at room temperature, or overnight at 4℃.

22)、一抗孵育

一抗用TBST1:1000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1.5小时，(或4℃过夜)摇床摇动。

Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml.

23)、清洗

将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。

24)、二抗孵育

二抗用TBST1:8000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1小时，摇床摇动。

25)、清洗

同22，之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分钟，以洗去膜上的Tween 20，因为它可以阻碍底物的沉积。

26)、显色

按如下配方配制显色液：

1mL水+1滴（大约50微升）试剂A(之后混匀)+1滴试剂B+1滴试剂C

将硝酸纤维素膜放入其中孵育，一旦显色，立即放入去离子水中终止反应。