当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。

被限制性内切酶切断的DNA分子片段，需要一种特殊的酶——DNA连接酶来缝合，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。

提高平末端连接效率的措施

①提高T4DNA连接酶的浓度；②提高DNA片段的浓度；③降低ATP浓度，以增强连接物与DNA结合；④加入多胺化合物，如亚精胺，降低DNA的静电排斥力；⑤加浓缩剂，如大分子排阻物聚乙二醇（PEG）、强水化物三氯化六氨钴等。