农杆菌介导转化的基本流程

农杆菌制备

转化

验证

拟南芥是一种模式植物，多年来围绕拟南芥的相关研究很多，尤其是对于拟南芥转基因研究非常热门，相关的论文也有很多。原因主要有以下几个方面：

1 拟南芥是一种模式植物，基因组小，克隆其基因比较简单。2 种植方便，条件易得。

3 拟南芥是自花传粉植物，这样既很容易进行遗传分析。

4 方法简单，不同于传统的植物转基因，不需要植物组织培养阶段，对于实验操作的要求不是很高。

当前拟南芥转基因所使用的方法主要是农杆菌介导的转化（载体法），区别主要是转化的方法不同，有抽真空，花序浸染和喷雾法使用最为广泛。

农杆菌介导转化的基本流程

农杆菌（目标载体）液的制备↘

拟南芥种植→花期（侵染）→共培养→收种→验证

农杆菌制备

1)从-80℃冰箱中取出lml农杆菌。

2)LB培养基中添加50mg/L的卡那霉素(Kan)和100mg/L的利福平(Rif)。

3)把lml农杆菌加入到含有Kan和Rif抗生素的LB培养基中，28℃振荡10h。

4）拟南芥转基因浸润液采用的是1/2MS，加蔗糖50g/L， PH值调至5.7。然后在15p压力下蒸汽灭菌15min，灭菌结束，冷却后保存于4℃，以待转基因使用。

转化

抽真空/花序浸染/喷雾法

其中抽真空法转化效率最高，但是步骤麻烦，而且要将拟南芥倒置浸染到菌液中，操作不方便。喷雾法相比来说简便易行，而且进行重复浸染，可以提高转化效率。

验证

1.种子筛选，将收到的种子种植于含有筛选剂（卡那霉素/潮霉素等）的培养基上，筛选出抗性幼苗。

2.PCR,提取拟南芥基因组，进行PCR扩增，核酸电泳观察有无目的基因。