酶细胞化学技术(enzyme cytochemistry)

将细胞内的酶与底物相互作用， 再将酶反应的产物作为反应物质，在酶的作用部位进行捕捉，使其在显微镜下具有可见性。这种在酶作用下产生反应产物， 经捕捉反应来间接证明酶定位的反应称为酶的细胞化学反应。

酶的细胞化学反应包括两个反应: 第一反应是酶作用于底物的反应， 称酶反应，形成的产物称为初级反应产物;第二反应是捕捉剂与初级反应产物的作用，称捕捉反应，产生最终反应产物：

┌────酶的细胞化学反应─────┐

│ 酶+条件　初级　捕捉剂 │

底物──→反应产物──→ 最终反应产物

（酶反应）　（捕捉反应）

实验方法

1、样品制备

酶细胞化学的一个重要问题是既要保存好细胞内酶的活性，又要保存好细胞的结构，因此选择适当的固定剂种类、浓度、固定的方式和时间是细胞化学技术的一个关键问题。光镜样品固定多选用中性福尔马林或多聚甲醛,4℃、24小时，常规的石蜡包埋切片可以满足相当一部分酶的细胞化学要求；电镜样品固定通常用0.5～2％戊二醛或4％多聚甲醛,4℃、2小时，再切成5～100μm的厚片用于细胞化学反应，反应后经常规的锇酸后固定，脱水、包埋、超薄切片、至电镜下观察。冷冻切片能较大限度地保存酶的活性，因此是光、电镜酶细胞化学技术中常用的方法。

2、酶细胞化学反应

酶细胞化学反应实际上就是孵育反应的过程，孵育液的成分主要有酶的底物、捕捉剂，保证孵育液pH 的缓冲液以及有关的添加剂等。孵育的温度和时间可根据不同的酶和组织通过实验而确定。电镜酶细胞化学的样品在孵育反应后需经锇酸后固定、梯度乙醇脱水、环氧树脂包埋和超薄切片，至电镜下观察。

3、基本实验过程

光镜样品： 固定（酶固定＋结构固定）→ 冷冻切片 → 细胞化学反应

（酶反应＋捕捉反应）→ 光镜观察

电镜样品： 固定（酶固定＋结构固定）→切组织片→细胞化学反应

（酶反应＋捕捉反应）→脱水包埋→ 超薄切片→电镜观察