| 词条 | SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳 |
| 释义 | § 概述 电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关，我们介绍其中常用的几种主要的电泳技术。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上，人们又发展了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用含有一种去污剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫键（使二硫键还原）。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS，大的蛋白质按比率可以结合更多的SDS。所有结合SDS的蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。 § 操作过程 SDS-PAGE中，去污剂既要加到凝胶介质中，也要加到电极液中，以便维持处理过的蛋白质样品的变性状态。 在蛋白质样品加到凝胶上后，接通电源，所有SDS-蛋白质复合物都向着阳极迁移（下图）。由于它们通过凝胶的速率与它们分子量的对数成反比，大的蛋白质会遇到更多的阻力，因此它们迁移的速度比小的蛋白质慢，这实际上是一种分子筛效应。但这种分子筛效应不同于凝胶过滤层析中的分子筛效应。在凝胶过滤层析中，大分子被排出在凝胶的孔径之外，因此移动很快；而在SDS-PAGE中，所有的分子都应穿过凝胶，很显然大分子的迁移是最慢的。由此就造成了各种蛋白质的迁移率的不同，结果反应在电泳后的凝胶上。凝胶通过染色（常用的考马斯亮蓝染料）出现不同的蛋白带。未知蛋白质的分子量（严格讲应是多肽链的分子量）可以通过与同一块凝胶上参考蛋白的迁移率相比较计算出来。在SDS-PAGE中，在一定的凝胶浓度下，蛋白质（实际上是多肽链）的分子量对数与多肽链的迁移率成线性关系，所以通过依据标准蛋白迁移率画出的标准蛋白分子量对数对它们迁移率的标准曲线，根据未知蛋白迁移率就可从标准曲线上求出未知蛋白的分子量。 SDS-PAGE基本上是一种分析工具，但有时也可用于纯化蛋白质。变性的蛋白质可以通过切下凝胶上的蛋白带的方法从凝胶中回收，然后再通过电洗脱仪将凝胶中的蛋白洗脱到缓冲液中，再经过浓缩和除盐，这样制备的蛋白样品可以用于蛋白质的结构分析或抗体的制备。 § 结构上的特点： ①聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起； ②链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛的性质； ③网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有抗对流的作用；④长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶； ⑤该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。[1] § 凝胶的质量决定因素 （1）凝胶度：是指100mg凝胶溶液中含有单体（Acr）和交联剂（Bis）的总克数，用T%表示。 （2）交联度：是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的百分数，用C%表示。一般浓缩胶的浓度为7.5%，分离胶的浓度为10%。 § 不连续PAGE的原理 第一、三个不连续性： ①凝胶孔径的不连续； ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续； ③在电场中形成的电位梯度的不连续。 第二、不连续系统中的三种物理效应： ①电荷效应： ②分子筛效应: ③浓缩效应: |
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