| 词条 | 聚合酶链反应技术 |
| 释义 | 聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction，简称PCR)又称体外酶促基因扩增。它以敏感，特异，快速的核酸分析技术而著称，是分子生物学技术的一项突破。由Mullis发明于1983年。经不断的改进，现今已发展出了不对称PCR（aeymmetri′c PCR），反向PCR（inveree PCR），多重PCR（multipex PCR），锚定PCR（anchored PCR），差异显示PCR（olol PCR），定量PCR（quantity PCR）等多种PCR技术。 基本原理PCR模拟于DNA的自然复制过程，引物按照碱基配对与DNA模板互补结合以后，在DNA多聚酶的作用下，按照碱基配对的原则（A、T，C、G），从引物开始合成与模板DNA互补的DNA链。经变性，退火，延伸等一次循环，DNA链数量增加一倍。聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术，可检出微量靶序列（甚至少到1个拷贝）。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时 内可扩增至100万-200万份拷贝。 技术步骤高温变性双链DNA模板在热作用下（一般在95℃），使氢链断裂，双链解离，形成单链DNA这一过程称之为变性。变性后的单链可以重新结合，形成双链，其他性质也同时复原。 低温退火模板DNA经过变性，分解为两条单链。经过系统温度降低，引物退火与互补的DNA模板结合，形成局部的双链，这也是DNA复制的起点。 中温延伸引物与模板结合后，在DNA多聚酶的作用下，从引物的5′端向3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性，退火和延伸，DNA含量即增加一倍。变性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模板，这样经过九小时的循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，这样经过数上时的循环后，可得到大量复制的特异性DNA片段。反应条件一般为94℃变性30秒，55℃退火30秒，70-72℃延伸30-60秒，共进行30次循环左右，最后再延伸72℃5分钟，4℃冷却终止反应。 影响因素引物C+G的核苷酸数应在45%～55%，以20个核苷酸为宜，如太短易出现错配，太长则易形成稳定的集合体。在一条引物内或一对引物间不应有5个以上的互补核苷酸。引物的浓度为0.1 μmol/L～1.0 μmol/L，就可完成30～35个循环的扩增，一般认为0.5 μmol/L已足够。过高浓度可能导致异位引导，可出现非靶序列的扩增。 PCR缓冲液在反应体系中不能含有高浓度的鳌合剂（如EDTA），及负电荷离子基团（PO-34）。Mg+2离子浓度要合适，它可影响引物的退火，模板和PCR中间产物的链解离，产物的特异性，引物二聚体的形成及酶活性等。Mg+2离子浓度也受DNA模板和鳌合剂的影响。 Taq酶无论市售国产或进口的，都是当前质量较好的酶。应以1～2 U为宜，如加酶过量除浪费外，还有可能导致非靶序列扩增，太低又会影响PCR产量。但在经25～30次循环以后，酶含量便成为制约反应进行的因素。此时如仍需扩增，应以产物为模板，再行第二轮扩增为好。 靶序列要以线性DNA作为模板最好。假如用质粒作反应模板，最好先将其线性化后再用。 退火温度取决于反应体系中引物的浓度，引物长度及其核苷酸的组成，温度以比引物扩增的Tm值〔（A+T）X2+（C+G）X4〕低5°为宜。温度过低会增加引物与模板之间的错配现象，特异性就会下降。 延伸时间和温度Taq酶的酶活性温度可在20℃～85℃之间。但温度太低会引起非特异性扩增现象的增加，太高则会引起引物与DNA之间的变性，因此一般选用72℃。延伸时间取决于所扩增片段的长度，片段长者时间要长，短者则要短。但在最后一次循环的延伸，为使所有的产物完整，时间可以更长。 循环次数亦取决于模板的浓度。模板浓度高者，循环次数少，低者循环次数可增加。一般循环30～35次足够。此时所得产物生成速度已经接近平台期，再增加循环次数不但不能增加产量，反而引起非特异性背景产量的增加，循环次数太少则产量就降低。 技术分类1.逆转录PCR(RT-PCR)用来扩增RNA的方法。 2.竞争逆转录PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低丰度RNA定量的好方法。 3.多重PCR（multiples PCR）在同一PCR体系中加入多对引物可用于基天长度很长，发生多处缺失的。 4.多种PCR可同时加入多套以生物素标记的引物起进手PCR反应。 5.反向PCR（iverse polymerase chain reaction）对一个已知的DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。 6.不对称PCR在扩增循环中引入不同引物浓度，以得到单链DNA并进行列测定，以了解目的基因的序列。 7.锚定PCR（anchored polymerase chain reaction）帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。 8.着色互补试验或荧光PCR（color complementation assay or fluorescent PCR）原理是用不同荧光染粒，分别标记于不同寡核苷酸引物上，同时扩增多个DNA片段，反应完毕后，利用分子筛选去多余的引物。用紫外线照射扩增产物，就能显示某一DNA区带荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区带荧光染色料颜色的组合，如果某一DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色。 9.双温PCR（two-temperature PCR）仅仅执行两步温度程序。合并退火与延伸温度。一般常用温度是94-95℃和46-47℃。可以提高反应的速度和特异性。 10.原位PCR技术：PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA，但扩增的DNA或RNA产物不能在组织细胞中定位，因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系，这是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力，但由于其敏感性问题，尤其是在石蜡切片中，尚不能检测出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR（In situ PCR,简称IS PCR），它可使扩增的特定DNA片段在分离细胞和组织切片中定位，从而弥补了PCR和原位杂交的不足，具有良好的应用前景。目前，已有多种设计的原位PCR扩增仪系统问世，使操作简便，软件灵活，已成为拉增固定细胞和石蜡包埋组织中特定DNA和RNA序列的有用工具。 应用领域(1)扩增各种蛋白的基因：可用于基因重组、蛋白表达、构建cDNA文库，目前所用的基因工程生物产品，绝大多数为通过PCR方法而获得的目的基因。 (2)PCR后的测序：可以很快地测出常规的PCR产物或单链的DNA序列。 (3)用于分子进化和种系发育的研究，因为在一些巨大分子的序列中含有足够的进化信息，通过PCR对其编码基因的扩增，并与较近或较远的种系比较，研究其分子进化及种系发育是很有用的。 (4)分析和诊断遗传性疾病，根据其基因的缺失或突变对其做出诊断。如甲型血友病、苯丙酮酸尿症、地中海贫血等有特定的遗传性基因，可以做出明确的诊断。 (5)对人类HLA基因的多肽性分析，用于器官移植的配型。比原有的免疫学方法要好得多，无论在准确性及特异性，检测的速度等方面都提高了许多。 (6)对于某些基因突变，如肿瘤发生的研究等均很有用。 技术应用范围（1）PCR技术扩增特定序列为基础，采用多种方法进行检测，如PCR-RFLP、PCR-SSCP从已克隆的双链DNA中产生特异性序列作为分子探针； （2）通过选择性扩增cDNA中产生特异性序列作为分子探针； （3）通过选择性扩增cDNA中的特殊片段，产生针对尚未克隆的基因的探针； （4）从微量mRNA中产生cDNA文库； （5）产生大量用于序列分析的DNA； （6）分析 基因突变； （7）做染色体步移。 |
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