变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是根据寡核苷酸的大小来分离，因此可将全长产物与不完整的短分子分开。原理：蛋白质或多肽与SDS结合，经热变性和二硫键的还原，形成所带负电荷相对一致的非折叠衍生物，其泳动速度主要由分子量决定。

简介

电泳实验步骤

简介

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是根据寡核苷酸的大小来分离，因此可将全长产物与不完整的短分子分开。电泳时通常每一泳道至少加1mg合成的寡核苷酸，电泳后在紫外灯下定位寡核苷酸条带，将长度正确的寡核苷酸从凝胶上切下。

电泳实验步骤

凝胶的制备：

凝胶由分离胶和浓缩胶组成：上层为浓缩胶，凝胶孔径较大，没有分子筛效应，其pH为6.8，由于快慢离子所形成的高电压梯度，使得变性蛋白质分子在泳动中被压缩为很薄的一层，大大提高了分辨率。下层为分离胶，凝胶孔径较小，有分子筛效应，pH为8.8，变性蛋白质分子所带负电荷基本一致，泳动速度主要决定于分子量。

制备顺序为先灌制分离胶，然后在分离胶上灌制浓缩胶： （四人一组）

1. 在两块玻璃板间夹以垫条，用手夹住玻璃板放入电泳槽主体内，缺口朝外，再插入斜楔板。

2. 拿一小烧杯，按下表加入各试剂： （12%分离胶）

单体溶液　4ml

分离胶缓冲液（pH8.8）　2.5ml

分离胶缓冲液（pH8.8）　3.3ml

10%SDS　100ul

10%TEMED　30ul

10%过硫酸铵　70ul3. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入两玻璃板间，灌注高度为红色背景下沿线。然后滴上少量水饱和异丁醇，静置约15分钟。

4. 待凝胶与异丁醇出现分层时，倒去异丁醇，用洗瓶冲洗凝胶顶部，然后拿一烧杯，按下表加入各试剂： （4%浓缩胶）

单体溶液　0.4ml

浓缩胶缓冲液（pH6.8）　0.38ml

超纯水　2.15ml

10%SDS　30ul

10%TEMED　15ul

10%过硫酸铵　30ul5. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入已制好分离胶的玻璃板间，灌满后，小心插入梳子，静置30分钟。

6. 待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。小心取出玻璃板，取掉垫条后，缺口朝内放入电泳槽主体，插入斜楔板。 两组用一个电泳槽主体，两组玻璃板间即为上槽。

7. 装好的电泳槽主体放入下槽，往上下槽加入 Tris－甘氨酸电极缓冲液。用滴管冲洗凝胶顶部，并赶走底层的气泡。

样品制备：

蛋白质样品需变性并结合SDS，形成所带负电荷相对一致的非折叠衍生物。四人一组，取一1.5离心管，加入30ul鼠IgG样品和30ul样品缓冲液，混匀后沸水浴5分钟，3000rpm离心数秒，每人取10ul加样。

电泳：

连接电泳仪，选择电压为40伏，蓝色指示剂移动至凝胶底部即停止电泳。取出玻璃板，用保鲜膜包好，置冰箱待明日做蛋白印渍（Western－Blotting）。