定 义

骨生长肽的发现及结构

骨生长肽的功能(2.1　促进骨形成 2.2　促进造血功能)

OGP的制备(3.1　细胞培养液提取分离法 3.2　固相合成法)

OGP（10～14）的制备(4.1　固相合成法 4.2　液相合成法 4.3　酶促合成法)

OGP（10～14）的衍生物及其活性

OGP及OGP（10～14）的临床应用前景(6.1　用于骨质疏松症的治疗 6.2　用于放疗化疗患者造血机能的恢复 6.3　用于骨髓移植患者机体恢复 6.4　其他方面的应用)

【别 名】骨生长肽,OGP（10-14）

【英文名称】osteogenic growth peptide,OG P

定 义

骨生长肽（osteogenic growth peptide,OG P）是由14个氨基酸残基组成的多肽，是一种对骨髓损伤有系统性应答的促进因子，以微摩尔级浓度存在于哺乳动物的血清中。OGP最早由再生骨髓中分离出，其C端的OGP（10～14）五肽是保持全部OGP样活性的最小氨基酸序列。OGP能刺激成骨细胞的活性，促进成骨细胞和成纤维细胞的生长，还能促进由基质微环境刺激所引起的继发性造血反应。OGP及OGP（10～ 14）对于骨质疏松症和血液系统病的研究和治疗具有重要价值。 构效关系

骨生长肽的发现及结构

近年来已有不少有关OGP, OGP（10～14)及其类似物的活性、合成方法及构效关系的研究报道。 早期的实验研究结果表明，骨髓损伤或去骨髓后，骨髓再生过程的早期有一个骨形成阶段，在骨髓中出现一个成骨相，形成暂时性骨小梁，随后骨小梁被破骨细胞吸收，骨髓得以再生。这些结果提示再生骨髓组织中含有可促进成骨细胞有丝分裂和骨形成的调节因子。

1992年，Bab等首次从再生骨髓的培养液中分离纯化得到一种含14个氨基酸残基的具有成骨作用的生长因子，命名为OGP，其一级结构为Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr- Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,该序列与组蛋白H4的C端（90～ 103）序列完全一致，即OGP的生物合成是通过改变组蛋白 H4 mRNA的翻译起始点完成的。OGP的相对分子质量为 1523，从人血清中提取的OGP的氨基酸序列同大鼠和小鼠的OGP氨基酸序列完全相同，并且与大多数动物具有同源性，显示出OGP的结构在进化上保守性，也提示不同哺乳动物体内的OGP可能具有相同的生物功能。这一发现极具生物学和医学价值。OGP也可以从体外培养的NIH 3T3成纤维细胞系,MC3T3 El成骨细胞系和ROS17/2.8骨肉瘤细胞中分离得到。 通过研究OGP的结构与生物功能的关系，发现OGP由其前体H4（85～103）经细胞内蛋白酶裂解而成，OGP的N 端能与OGP结合蛋白(OGP binding protein,OGPBP)结合形成复合物OGP-OGPBP。α2-巨球蛋白（α2-macroglobulin, α2M）是其中的一种主要OGPBP。α2M最初以“天然型”存在于血清中，与蛋白酶共价结合后转变成“激活型”。OGP可与这两种形态的α2M非共价型地结合。天然型α2M-OGP复合物帮助 OGP向靶细胞传输，同时有效地保持血液中OGP的贮存量，防止其被降解和消除；激活型α2M-OGP复合物则倾向于通过加热或竞争反应将OGP游离出，成为有免疫反应活性的 irOGP（immunoreactive OGP）。游离irOGP的主要形式是OGP (10～14)，即Tyr10-Gly11-Phe12-Gly 13-Gly14。自然状态下的人血清和大鼠成骨细胞培养液中也含有由OGP水解产生的 OGP(10～14），它是OGP的活性片段。进一步对OGP (10～14)的5个氨基酸进行结构修饰研究发现，Tyr的酚羟基、Phe的芳香环是其中必需的活性基团，OGP（10～14）的完整序列是保持全长OGP活性的最小片段。内源性OGP的分泌量受反馈机制调控，给予低剂量外源性OGP时，血清中内源性OGP水平升高，但增大剂量使OGP水平达峰值后再增加反而抑制内源性OGP水平。调控机制尚待研究，可能与复合物OGP-OGPBP与OGP受体的作用方式有关。

骨生长肽的功能

2.1　促进骨形成

给正常大鼠皮下注射OGP，能增加骨小梁、类骨质厚度和矿化积沉率，提示OGP可促进正常矿化骨的形成。对骨折兔给予OGP治疗后，血清中的碱性磷酸酶和骨钙素水平升高，表明促进了骨形成。体外实验也证实OGP可刺激成骨细胞和成纤维细胞的增生，促进骨基质矿化，并能增强碱性磷酸酶的活性。在培养大鼠的MC3T3 El成骨细胞液和NIH 313成纤维细胞液中加入OGP可促进这些细胞的增殖；在大鼠骨髓细胞培养液中加入OGP，能明显刺激骨髓基质钙化；在大鼠成骨细胞培养液中加入OGP，碱性磷酸酶和骨钙浓度显著升高。OGP（10～14）具有等同的活性。

2.2　促进造血功能

OGP可调节骨髓基质细胞增殖，对整个造血系统有促进作用。给正常小鼠注射OGP后，骨髓细胞数增多约40%，白细胞数升高50%以上，而且不会改变这些细胞之间原来的比例。OGP也可通过上调成骨细胞和其他骨髓细胞系产生的造血刺激因子，而为继发性造血提供好的基质微环境。 OGP（10～14）同样可作用于人骨髓干细胞、外周血和脐血，使粒细胞集落刺激因子（GCSF），粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）活性增强，其白细胞数和外周血干细胞数增加。研究结果显示，OGP和OGP（10～14）能刺激各种血细胞数量平衡增加，不会破坏造血干细胞增生所需的微环境。

OGP的制备

3.1　细胞培养液提取分离法

OGP最早由再生骨髓培养液中分离纯化而得。将大鼠体外再生骨髓细胞培养液超滤，热变性后的均相滤质经体积排斥色谱、阳离子交换色谱和反相高效液相色谱分离，得到纯度为99%的OGP。OGP也可从哺乳动物的血清中提取分离得到。

3.2　固相合成法

可选择适当的固相载体、α-氨基保护基和侧链保护基，适当的偶联剂对OGP进行固相合成。固相载体可选择4-甲基二苯甲胺树脂、羟甲基树脂。α-氨基保护基可选用芴甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基（Boc），苄氧羰基（Z）。当使用Fmoc 系统进行固相合成时，可选用下列被保护的氨基酸残基： Fmoo-Leu，Fmoc-Tbr（But），Fmoc-Gly，Fmoc-Lys（Boc），Fmoc-Gln （Trt）Fmoc-Tyr（But）和Fmoc-Arg（Pbf）；使用Boc系统进行固相合成时，可选用下列被保护的氨基酸残基：Boc-Leu，Boc-Thr （Bzl），Boc-Gly，Boc-Lys（Clz），Boc-Gln，Boc-Tyr（Brz），Boc-Arg （Tos）；使用Z系统进行固相合成时的情况与Boc系统类似。偶联剂可选用：二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺 (DIC)，同时可用羟基苯骄三氮唑（HOBt）或7-氮杂羟基苯并三唑（HOAt）作为活化剂。首先将α-氨基被保护的Gly的C 端连接到固相载体上，按照给定的氨基酸序列，由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用三氟醋酸或氟化氢将OGP肽从树脂上切割下来并去除各保护基，经提取得到粗品，再经色谱析脱盐，高效液相色谱法进一步纯化，得到纯度99%以上的OGP。

OGP（10～14）的制备

4.1　固相合成法

OGP（10～14）的固相合成法与OGP的C端五肽的固相合成方法类似。将OGP(10～14）中C端的Gly的羧基与高分子固相载体以共价键相连，α-氨基的保护基亦可选用 Fmoc，Boc或Z，由C端至N端按给定顺序经脱保护、缩合、再脱保护、缩合的反复过程得到P-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-Resin(P 为保护基Fmoc，Boc，或Z，Resin为树脂载体)，再经割除树脂和脱去保护基步骤，得到OGP(10～14)。

4.2　液相合成法

选用DCC或有机磷化合物DEPBT作为缩合剂，在二甲基甲酞胺（DMF）或（DCM）溶剂中首先合成Boc-Tyr（Brz）－ Gly-Phe-OMe与Boc-Gly-Gly-OMe，继采用3+2的肽合成路线，将二肽片段经TFA脱除Boc保护基、三肽片段经皂化后缩合得到Boc-Tyr（BrL)-Gly-Phe-Gly-OMe,再经皂化和脱氨基保护基，得到OGP（10～14）。

4.3　酶促合成法

由于酶促肽合成法具有立体专一性好，反应条件温和，环境污染小等优点，这一方法也被应用到OGP（10-14）的合成中。可采用3＋2或2+3的合成路线，在有机溶剂中进行全酶法合成。在2+3的路线中，分别以α-胰凝乳蛋白酶作为催化剂，合成二肽片段Z-Tyr-Gly-OH和三肽片段Z-Phe-Gly- Gly-OEt或Boc-Phe-Gly-Gly-OEt,再将三肽片段脱除氨基保护基后，在嗜热菌蛋白酶催化下，与二肽片段进行缩合，得到Z- Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OEt,经皂化和脱氨基保护基得到OGP(10 ～14）。而在3+2合成路线中，用α-胰凝乳蛋白酶催化缩合得到Z-Tyr-Gly-Me,再在木瓜蛋白酶催化下缩合得到三肽片段Z-Tyr-Gly-Phe-OMe,经皂化后在α-胰凝乳蛋白酶催化下，与二肽片段H-Gly-Gly-OEt缩合得到Z-Tyr-Phe-Gly-Gly-OEt，再经皂化和脱氨基保护基得到OGP（10～14）。2＋3合成路线的收率高于3+2的合成路线。

OGP（10～14）的衍生物及其活性

构效关系研究结果表明：OGP（10～14）作为保持 OGP活性的最小片段，Tyr（10），Phe（12），Gly（13）和Gly（14）是保持OGP活性所必需的氨基酸残基，Tyr（10）和Phe（12）的边链是必不可少的药效基团，且C末端的羧基相对于Tyr和 Phe的位置对OGP(10～14)的生物活性也起重要作用。进一步的实验研究结果表明，OGP（10～14）N末端的氨基脱去得到daOGP（10～14）仍能在体外试验中保持70%的OGP活性，在体内试验中保持100%的OGP活性。当OGP(10～14)中有任意一根肽键被CH2NH、CONMe或CH2CH2取代时，得到的衍生物仍能保持OGP（10～14）的部分活性。OGP（10～14）的线性反式反转异构体H-Gly-Gly-D-Phe-Gly-D-Tyr-OH具有（OGP (10～14）的活性。另一方面，OGP（10～14）末端对末端环化得到的环五肽C(Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly)也保持了OGP(10～14) 的活性，其反式异构体C（D-Tyr-Gly-D-Phe-Gly-Gly），反转异构体C(Gly-Gly-Phe-Gly-Tyr)，反式反转异构体C(Gly-Gly-D-Phe- Gly-D-Tyr)都具有与OGP (10～14)类似的活性。以上OGP （10～14）的环肽类似物中，C（Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly），以Gly-Gly- Phe-Gly-Tyr), C (Gly-Gly-D-Phe-Gly-D-Tyr)的活性已超过OGP (10~14），以反式反转环肽C (Gly-Gly-D-Phe-Gly-D-Tyr）的活性为最好。此外，以Pro代替Gly11,所得到的线性的［Pro11］OGP（10～14）和环状的C［Pro11]OGP（10～1 4）均具有与 OGP(10～14）类似的活性。这一系列研究结果提示，肽的骨架并非其识别分子靶标并与之相互作用的关键因素，它只是药效基团在与生物学相关的布局下的带有特定空间间距的载体。这些OGP（10～14）的活性类似物为新药的研究与开发提供了有益的思路。

OGP及OGP（10～14）的临床应用前景

6.1　用于骨质疏松症的治疗

骨质疏松会引起全身骨量减少、骨钙流失、骨脆性增加、骨质变得疏松多孔，使骨折发生率增加。骨质疏松症的治疗通常采用促进骨形成和抑制骨流失两种方法，OGP属于前者，后者有雌激素、降钙素等。雌二醇能与雌激素受体高度亲和，表现雌激素受体激动剂活性，抑制破骨细胞活性，减少骨钙流失。但对乳腺和子宫内膜有刺激作用，长期使用有引发乳腺癌和子宫内膜癌的危险。降钙素是调节钙代谢的内源性激素，能直接作用于破骨细胞上的降钙素受体，抑制破骨细胞对骨的吸收，缺点是容易引起甲状旁腺功能亢进和产生抗体。OGP及OGP（10～14）是内源性的成骨生长因子，直接作用于成骨细胞。陈统一等利用大鼠骨质疏松模型，对鲑鱼降钙素和合成OGP进行了实验比较，结果表明，OGP具有很强的促成骨细胞和成纤维细胞活性的作用，能促进骨量增加，防止骨流失；而鲑鱼降钙素是通过抑制破骨细胞活性而达到提高骨量的效果，OGP的作用效果优于鲑鱼降钙素。且OGP以自分泌和旁分泌的方式行使其调节功能，合成OGP避免了长期使用可能造成的免疫原性，因此不良反应较少，在骨质疏松症的预防和治疗方面前景广阔。

6.2　用于放疗化疗患者造血机能的恢复

当患者接受放疗化疗后，血细胞数量全面下降。通常采用粒细胞集落刺激因子（G-CSF），粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子（GM-CSF）等生血因子进行治疗。这些因子主要作用于造血干细胞，使其定向分化为不同的白细胞，从而使白细胞和中性粒细胞的数量增加，不能平衡地引起多细胞系的反应，需结合其他因子共同使用才能有效地全面恢复患者的造血机能。由于许多肿瘤细胞也含有GCSF和GM-CSF受体，因而有导致残存癌细胞增生，引起肿瘤复发的危险。 OGP及OGP(10～14）作为内源性肽，对机体的整个造血功能都有明显的促进作用，且不刺激上皮细胞的增生，也不增加细胞对基质的黏附，是一种理想的生血因子。

6.3　用于骨髓移植患者机体恢复

骨髓移植是各种血液肿瘤、再生障碍性贫血、重度地中海贫血症及一些先天性免疫缺乏或者代谢疾病的根本治疗方法。减少骨髓移植的治疗时间，就能减少患者被感染的机会，促进健康的早日恢复。OGP对各类造血细胞都有刺激作用，通过改善骨髓造血微环境，上调成骨细胞和其他骨髓细胞系产生的造血刺激因子，非选择性地刺激白细胞、红细胞和血小板的增殖，并增加骨髓细胞数。Gurevitch等的实验研究结果表明，在辐射引起重度骨髓抑制并进行骨髓移植前给予小鼠OGP，移植后30d的生存率比对照组高89%，白细胞数升高超过50%，骨髓细胞数增多40%，而细胞分类比例不变，提示OGP一方面可在短时间内促进移植的骨髓生长，另一方面可以通过促进造血干细胞的定向分化来全面促进血细胞水平的恢复。从作用机制来看，OGP及OGP（10～14) 对骨髓移植患者的恢复治疗比G－CSF和GM-CSF效果更全面，不良反应较小，对骨髓供体的骨髓抽取量也较少。

6.4　其他方面的应用

OGP及OGP（10～14）还可用于体弱贫血者、体能过度消耗者的体能恢复，可用于骨折延迟愈合或不愈合患者治疗时间的缩短和治疗效果的改善。另外，OGP在整形外科手术和骨科手术方面也可应用。 OGP作为一种有丝分裂原，对成骨细胞和骨髓造血干细胞的促分裂增生作用，为临床上骨质疏松症和血液系统疾病的治疗提供了新的途径，对OGP的最小活性片段OGP（10～ 14）的研究，为骨生长肽作为药物开发和保健品研发提供了非常好的基础。目前市场推广和使用比较广泛的肾骨元素3+、骨动能等产品都是非常具有价值的骨关节修复类产品，其特点是能够在修复骨细胞的同时增加人体的循环系统功能和免疫机能，彻底解决骨关节疾病的根源问题，同时可以使股周围组织及骨连接得以修复，具有极大的推广价值。