差别杂交(differential hybridization)又叫差别筛选(differential screening)，适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。从本质上讲，差别杂交也是属于核酸杂交的范畴。它特别适用于分离在特定组织中表达的基因、在细胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节的基因、以及在特定发育阶段表达的或是参与发育调节的基因，同时亦可有效地用来分离经特殊处理而被诱发表达的基因。目前，差别杂交筛选法在克隆基因的分离工作中有着相当广泛的用途。

差别杂交的技术基础十分简单，它不需要任何有关的目的基因的核苷酸序列信息，而重要的是耍拥有两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同的mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA种的总mRNA群体，其二是不含有目的基因mRNA种的总mRNA群体。因此，可以通过这两种总mRNA(或是它们的cDNA拷贝)为探针的平行杂交，对由表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应，在x光底片上呈现黑色斑点，而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在x光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片井对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落，供作进一步研究使用。

差别杂交筛选技术已被成功地用于分析爪蟾和粘菌(Dictyostelium)的发育问题。这两个实际例子表明，处于不同发育状态或阶段的丰度相差5倍的特异的mRNA种是能够被检测出来的。生长因子调节基因(growth factor—regulatedgene)的克隆，是差别杂交成功应用的一个典型例子。我们知道，血清中含有生长因子，因此用血清处理处于静止期的细胞时，便会迅速诱发生长因子调节基因进行表达。所以，分别从静止期细胞培养物和经血清澈活3小时的细胞培养物中提取的poly(A)mRNA制剂，在mRNA种类上是有差别的，至少后者比前者多出了一种生长因子调节基因的mRNA种。用从激活细胞中分离的poly(A)mRNA反转录合成的cDNA与^噬菌体载体重组，构成eDNA文库，并同时复制两份硝酸纤维素滤膜。A组滤膜同血清激活细胞制备的cDNA探针杂交，B组滤膜同静止期细胞制备的cDNA探针杂交。将所得的放射自显影图片进行仔细的比较，从中鉴定出只同激活细胞探针杂交而不能同静止期细胞探针杂交的噬菌斑位置。这些克隆便有可能是带有受血清诱发表达的生长因子调节基因的DNA编码序列。 应用差别杂交技术分离克隆的目的基因存在着诸多方面的局限性。首先，差别杂交的灵敏度比较低，特别是对于那些低丰度的mRNA而言，这个缺点就显得更加突出。这是因为在差别杂交中所使用的杂交探针是mRNA反转录成的cDNA群体。在这些同位素标记的探针中，真正能与目的基因核苷酸序列完全互补的仅占很低的比例，以至于那些低丰度的mRNA之cDNA克隆，是很难用此法检测出来的。其次，差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片段，因此是十分耗费时间和金钱的工作。况且两套平行转移的滤膜之间，DNA的保有量往往是有差别的，这样所得的杂交信号的强度也就不会一致，需要重新进行点杂交，以作进一步的阳性克隆鉴定工作。所以说重复性差是差别杂交筛选法的又一个缺点。

扣除杂交技术在理论上很具吸引力,但实际操作并不容易:首先是回收cDNA量有限,并仍存在重复性差,敏感度低的缺点,这些均限制了这一技术更广泛的使用。