cRNA探针是以cDNA为模板在体外转录而成的探针，可方便地通过已克隆于特定质粒载体的DNA产生。这些质粒通常在紧邻多克隆位点的位置含有一个噬菌体启动子。应用相关的RNA聚合酶和4种核糖核苷(rNTPs)(其中至少一种带有标记物)进行体外转录反应，依赖DNA的RNA聚合酶以克隆的cDNA为模板，以含有标记物的三磷酸核糖核苷为原料，从启动子下游开始在体外转录产生RNA。通过改变外源cDNA在质粒中的插入方向或选用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的转录方向(即以cDNA的哪条链为模板转录RNA)，从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA探针(senseprobe)或与mRNA互补的反义RNA探针(antlsense probe)，后者即互补RNA(cRNA)探针。通常用同义RNA探针作cRNA探针的阴性对照。

由于在体外转录反应物中可提供有标记物标记的核苷酸为原料．因此经过体外转录就能得到标记的cRNA探针。cRNA探针是单链探针，故以cRNA探针进行杂交反应可避免应用双链cDNA探针作杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。cRNA和mRNA之间形成的杂交体要比cDNA-mRNA杂交体稳定。因此杂交反应后可经受高度严格洗涤。cRNA-mRNA杂交体不受RNA酶的影响，故杂交后还可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。此外，体外转录合成的cRNA探针的长度比较一致。由于cRNA探针具有以上优点，因此在分子杂交中，特别是在原位杂交中的应用较广泛。但cRNA探针的制备过程较复杂，需要较高的分子生物学实验条件，cRNA对RNA酶敏感，易被RNA酶破坏，因而在操作过程中需严格防止RNA酶污染。