RFLP是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。RAPD 技术是1990 年发明并发展起来的，RAPD是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction)基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板， 以单个人工合成的随机多态核苷酸序列( 通常为10 个碱基对) 为引物，在热稳定的DNA 聚合酶( Taq 酶) 作用下，进行PCR 扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。

第一节 概 述

第二节　RFLP技术(一、 材料 二、设备 三、试剂： 四. 操作步骤)

第三节 RAPD技术(一、 材料 二、设备 三、试剂 四、操作步骤： 五、RAPD技术原理及特点 六、RAPD分析的优越性和不足 七、RAPD技术本身存在的问题及对策)

第一节 概 述

遗传标记是研究物种进化不可缺少的工具,遗传学和育种学更离不开遗传标记;遗传标记的每次进步都会使这些相关学科有一个飞跃式发展。分子生物学发展的产物DNA标记技术为物种起源、进化、分类以及生物遗传育种等研究带来新的曙光。DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。

运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短, 但由于各种的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。

本实验将学习RFLP的酶切,电泳和膜的制作以及RAPD技术。探针标记及杂交检测方法请另详见分子杂交技术。

第二节　RFLP技术

RELPs标记限制性片断长度多态性(Restriction FragmentI~．gth Polymorphism，RnPs)标记，作为遗传分析的工具，开始于1974年，从20世纪80年代开始于植物，是较早应用于基因标记的一项分子技术。RFLP标记是由于不同基因型之中内切酶位点的碱基插入、缺失、重组或突变，利用限制内切酶消化基因组DNA时，会产生大小不同的DNA片段，电泳后通过Southem印迹杂交，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，然后用特异的探针进行杂交，最后通过放射性自显影或其他显色技术显示杂交结果，从而揭示出DNA的多态性。RFLP标记⋯是最早用于构建遗传图谱的DNA分子标记，截至目前，各种作物的遗传图谱中RFLP标记占大多数。其优点是：无表型效应，其检测不受环境条件和发育阶段影响；共显性，可以区别纯合基因型和杂合基因型；可利用的探针很多，可以检测到很多遗传位点。缺点是对DNA质量要求高，需要量大，操作复杂，通常要接触放射性 。

一、 材料

基因组DNA(大于50kb,分别来自不同的材料)。

二、设备

电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸 ，eppendorf管(0.5ml)若干。

三、试剂：

1、限制性内切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。

2、5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。

3、变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。

4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。

5、10×SSC：配方见第九章。

6、其它试剂：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。

四. 操作步骤

1. 基因组DNA的酶解

(1) 大片断DNA的提取详见基因组DNA提取实验,要求提取的DNA分子量大于50kb, 没有降解。

(2) 在50μl反应体系中,进行酶切反应:

5μg基因组DNA

5μl 10×酶切缓冲液

20单位（U）限制酶(任意一种)

加ddH2 O, 至50μl

(3) 轻微振荡, 离心,37℃反应过夜。

(4) 取5μl反应液,0.8%琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30kb的明显亮带出现。

[注意] 未酶切的DNA要防止发生降解, 酶切反应一定要彻底。

2. Southern转移

（1） 酶解的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳(可18V过夜)后EB染色观察。

（2） 将凝胶块浸没于0.25mol/L HCl中脱嘌呤, 10分钟。

（3） 取出胶块, 蒸馏水漂洗, 转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。

（4） 预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10×SSC中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物, 以10×SSC盐溶液吸印,维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。

（5） 取下尼龙膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速转至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分钟。

（6） 将膜夹于2层滤纸内, 80℃真空干燥2小时。

（7） 探针的制备和杂交见第九章分子杂交部分。

[注意] 1、 步骤（2）中脱嘌呤时间不能过长。

2、 除步骤（1）、（4）、（5）外, 其余均在摇床上进行操作。

3、步骤（4）中,当尼龙膜覆于胶上时, 绝对防止胶与膜之间有气泡发生, 加盖滤时也不应有气泡发生。

4、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP的差异，这时应该试用另一种酶。

第三节 RAPD技术

RAPDs标记 随机扩增多态性(Random Ampli~a PolymorphicDNA，RAPDs)标记是Williams等于1990年建立的通常以1O碱基的寡核苷酸序列为引物，对基因组DNA随机扩增，从而得到多态性图谱作为遗传标记的方法。与RFLP相比，RAPD的优点是对DNA质量要求不高，需要量极少，操作简单易行，不需要接触放射性，一套引物可用于不同生物的基因组分析，检测整个基因组，两条引物配对使用，能产生新的带型，

— 4 —江苏农业科学2003年第2期可以找到更多的标记，但不足之处是，绝大部分RAPD是显型标记，不能区分基因型是纯合或是杂合的，每个标记提供的信息量少，再者重复性差。RAPD标记一般为重复序列，若不是重复系列，也可将其转化为RFLP标记，进一步检测RAPD分析的结果。

一、 材料

不同来源的DNA(50ng/ul)。

二、设备

PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置。

三、试剂

1、随机引物(10mer) (5umol/L)：购买成品。

2、Taq酶：购买成品。

3、10xPCR 缓冲液：配方见第八章。

4、MgCl2 ：25mmol/L。

5、dNTP：每种2.5mmol/L。

四、操作步骤：

1. 在25ul反应体系中,加入

模板DNA 1ul (50ng)

随机引物 1ul (约5pmol)

10xPCR Buffer 2.5ul

MgCl2 2ul

dNTP 2ul

Taq酶 1单位（U）

加ddH2O 至 25ul

混匀稍离心, 加一滴矿物油。

2. 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 36℃ 1分钟， 72℃ 1分钟，共40轮循环。

3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。

4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100V（电压低带型整齐， 分辨率高）。

5. 电泳结束，观察、拍照。

[注意] 1、电泳时一般RAPD带有5-15条, 大小0.1-2.0kb。

2、 特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。

五、RAPD技术原理及特点

原理RAPD技术是建立在PCR技术的基础上，它用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链(一般为10个bp)作为引物，对所研究的基因组DNA进行单引物扩增。模板DNA经90—94变性解链后在较低温度(36～37℃)下退火，这时形成的单链模板会有许多位点与引物互补配对，在72℃下，通过链延伸，形成双链结构，完成DNA合成。重复上述过程，即可产生片段大小不等的扩增产物，通过电泳分离和显色便可得到许多不同的条带，从中筛选出特征性条带。扩增产物片段的多态性反映了基因组DNA的多态性。如果基因组在这些区域内发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点的分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。因此，通过对PCR产物的检测即可测出基因组DNA在这些区域的多态性。进行RAPD分析时，可用引物的数量很大，虽然对每个引物而言，其检测基因组DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。

RAPD技术的优点：①不使用同位素，减少了对工作人员健康的危害；②可以在物种没有任何分子生物学研究的情况下分析其DNA多态性；③对模板DNA的纯度要求不高；④技术简单，无需克隆DNA探针，无需进行分子杂交；⑤灵敏度高，可提供丰富的多态性；⑥RAPD引物没有严格的种属界限，同一套引物可以应用于任何一种生物的研究，因而具有广泛性、通用性。

但是，RAPD技术较易受到各种因素的影响。无论是模板的质量和浓度，短的引物序列，PCR的循环次数，基因组DNA的复杂性，技术设备等，都有可能是RAPD技术重复性差的直接原因。目前，多从以下几个方面来提高反应的稳定性：①操作规范，反应体系的组成要力求一致，尽可能地使RAPD反应标准化；②提高扩增片段的分辨率；③将RAPD标记转化为SCAR标记后再进行常规的PCR分析，可以提高反应的稳定性及可靠性。

2　RAPD技术在鱼类、虾蟹类研究中的应用

2.1在遗传资源研究中的应用

目前，海产虾、蟹类遗传变异的检测大多通过检测同工酶的变异来进行，所揭示的同工酶的多态性相对较低。RAPD分析中所需的样品量极少，其操作程序简单易行，实验周期短，因而可以对数量较多的样品进行分析。利用一套引物可得到不同种属、品系、群体甚至是个体的大量的RAPD分子标记，并可借助于计算机进行系统分析，RAPD技术的这些特点使得它可以在虾、蟹类群体遗传学、遗传多样性分析中发挥重要作用。

RAPD标记可以用来进行虾、蟹类群体遗传学研究，检测种群内、种群间的遗传多样性水平，并为种群识别提供可靠的遗传标记。Garcia等尝试在斑节对虾中利用RAPD分析不同地理群体间的遗传多样性，并就其在虾类选育中的应用作了初步探讨。Garcia以及A1civar—Warren等在高健康(High Health Shrimp)和无特异病原(Specific—Pathogen—Free，SPF)的南美白对虾培育中，用RAPD技术对野生种群以及不同的家系进行监测和分析，发现其多态位点的比例为50%左右，其中一个家系的多态位点比例高达77%。刘萍等用RAPD技术对中国对虾黄渤海沿岸种群亲本及子一代的基因组DNA多态性进行了研究，结果证实子代之间的遗传距离比其父母与子代之间更小，遗传变异程度更低。邱高峰等用RAPD技术分析了我国近海烟台、长岛等4个地方的20只中国对虾的种群内和种群间遗传差异，结果表明不同地理种群之间存在一定程度的遗传差异。石拓等，刘萍等、刘振辉等对中国对虾不同地理种群的遗传多样性进行了RAPD分析，结果表明，中国对虾的遗传多样性水平较低。高志干等对中华绒螯蟹的辽河和长江种群进行RAPD分析，结果显示，其种内遗传变异较低，3个种群中，辽河种群和颐江种群遗传变异较高，而长江种群遗传变异较低；辽河种群间遗传距离小于它们与种群间的遗传距离。甘西等利用RAPD技术对罗氏沼虾的NY群体和NX群体的遗传多样性进行了研究，NY群体的变异明显小于NX群体。宋林生等及庄志猛等用RAPD技术研究了日本对虾野生种群和养殖种群的遗传结构，结果表明，野生种群多态性位点的比例和杂合度明显高于养殖群体，说明中国沿海的日本对虾野生种群的种质资源状况较好，应加以保护。

一个较为详细的遗传连锁图谱不仅对该物种的遗传学基础研究有重要意义，同时对该物种的育种研究也很有帮助。Potlethwait和Stephen等用RAPD技术进行斑马鱼遗传连锁图谱的制作。Liu把RAPD技术应用到鲶鱼基因图谱研究中。孙效文等建立了鲤鱼的遗传连锁图谱。图谱有RAPD分子标记56个，鲤鱼的SSLP标记26个，鲫鱼的SSLP标记有19个，斑马鱼的SSLP标记有70个，鲤鱼基因标记91个，图谱有50个连锁组，连锁图给出鲤鱼的基因组大小在5789cm左右。

2.2确定种、品种间的亲缘关系

种群亲缘关系的传统研究方法是从形态学、细胞学、生化指标等方面进行，但受个体和环境的影响较大，有时不能反映物种本身所固有的特征。物种基因组的组成在RAPD图谱上得到体现，亲缘关系越近，基因组中的同缘序列越多，则以相同引物扩增出的共有标记也就越多。因此，RAPD技术与传统方法结合是研究物种亲缘关系的有效手段。对不同种、同种不同群体的DNA进行RAPD分析，筛选出特征性条带，计算相似系数和遗传距离，从而可确定它们的亲缘关系。李思发等用RAPD技术研究中国沿海六水系绒螯蟹(中华绒螯蟹和日本绒螯蟹)群体的亲缘关系，从48个引物中筛选出2个具有群体特异性的引物，其中Z2扩增的880bp片段为珠江蟹和南流江蟹两群体所共有，扩增的700bP片段为长江蟹、黄河蟹、辽河蟹、瓯江蟹四群体所特有。这可作为区别中华绒螯蟹(长江蟹、黄河蟹、辽河蟹、瓯江蟹)和日本绒螯蟹(珠江蟹、南流江蟹)的分子遗传标记。用RAPD技术对中国沿海六水系绒螯蟹进行两大类型划分与生化遗传差异分析、形态特征多元分析的结果一致。宋林生等用RAPD方法研究对虾属六个种间的亲缘关系，用20个随机引物扩增，共得到364条清晰稳定的多态性片段，根据扩增片段的共享度计算相对遗传距离指数，然后用UPGMA和NJ等聚类方法对其进行分析，构建系统树，确定了它们之间的亲缘关系。聚类分析的结果为：中国对虾、长毛对虾和墨吉对虾三者的关系最近，它们首先聚类在一起，然后与斑节对虾聚在一起，最后是南美白对虾和日本对虾。从其结果可以看出，外部形态比较相似的种类在基因组DNA上表现出较大的相似性，反之则较小。宋林生等用RAPD方法研究六种海产虾类基因组DNA多态性，结果显示六种虾的亲缘关系与传统的分类结果基本一致。谢浩等用RAPD方法研究三种绒螯蟹的亲缘关系，用一组引物对每种各10个个体的基因组DNA进行扩增，得到一批特异、可重复的扩增图谱。扩增区带相似串的分析结果表明，中华绒螯蟹与日本绒螯蟹的亲缘关系较远，而南流江的绒螯蟹(合浦亚种)与日本绒螯蟹较近。

Borrwsky等用随机引物扩增产物重新构建了脊椎动物DNA指纹图。Sultman等用DNA标记对丽鱼科鱼类的系统发育进行了研究。何舜平等运用RAPD的方法对五种鲤科鱼类进行了分析，并论述了鮈鲫的系统位置。何舜平等通过对鲤科鱼类的随机扩增，获得了大量有系统发育信息的DNA多态片段，并绘制了低等鲤科鱼类代表属种的分支系统图。夏德全等用RAPD方法分析太湖大银鱼、太湖新银鱼和寡齿新银鱼的亲缘关系，同时发现有个别样品的核基因组与太湖中已有的几种银鱼有显著差异。邹曙明等用RAPD方法研究草鱼、柏氏鲤和3个地理种群鲤的亲缘关系，研究结果支持中国东部鱼类具有双重来源性的观点。

2.3特定基因的标记

利用DNA分子水平上的变异作为遗传标记进行基因标记已成为可能。周开亚等用RAPD方法研究鉴别中华绒螯蟹种群，用200个随机引物对中华绒螯蟹辽河种群、长江种群和瓯江种群进行RAPD分析，其中引物HX01和HX02检测到瓯江种群和辽河种群所有样品共有HX01—0.4和HX02—0.7扩增片段；而长江种群样品的PCR反应中无这两个扩增片段出现，因而可作为长江种群的鉴别标记。未发现可区分瓯江种群和辽河种群的标记。谢浩等用RAPD方法研究三种绒螯蟹的亲缘关系，用引物OPO—05对25个中华绒螯蟹个体、27个日本绒螯蟹个体及12个日本绒螯蟹合浦亚种个体扩增，发现中华绒螯蟹所有个体都能扩增出一条大小约为1kb的区带，且相当明显和稳定，而其它两种在相同条件下仅有个别个体能扩增出相当微弱的区带。因此，可将这一区带作为一个遗传标记，用于鉴别中华绒螯蟹与日本绒螯蟹及其合浦亚种。

目前RAPD已广泛应用于鉴别、鉴定不同的生物种类。Johnson用RAPD技术鉴定了不同实验室品系的斑马鱼。薛国雄对长江、珠江、黑龙江三大水系的草鱼产卵场及太湖中捕捞的草鱼进行覆盖性的RAPD分析，结果表明每一水系的草鱼种群均有其特征性基因图谱，可作为种群鉴定的依据。夏德全等应用该技术检测了一个奥利亚罗非鱼养殖群体和湘湖，美国和沙市三个尼罗罗非鱼养殖群体，获得了鉴别尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的分子遗传标记。姚纪花等利用20个随机引物对产于方正、彭泽和淇河地区的三个银鲫种群进行了RAPD检测，也获得了银鲫种群鉴定的分子标记。邓怀等对青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲫鱼、鲤鱼、团头鲂、胭脂鱼、土鲶和黄颡鱼进行了RAPD—PCR扩增。结果显示RAPD是一种非常灵敏的种间鉴定技术，特别是对鱼卵和鱼苗的鉴定有重要意义。郑光明等以池养的鲮、麦鲮为材料，提取血液基因组DNA，利用随机引物进行PCR扩增，通过缩短扩增时间和电泳时间，快速鉴定了三种不同的鲮鱼，并建立了一套DNA分子水平上的快速鉴定鱼种的方法。

2.4识别同一物种的性别差异

虾、蟹的性染色体没有统一的模式，用常规核型分析方法不能鉴别性染色体。通过RAPD技术可找出同一物种不同性别的基因组DNA特征性条带，从而有助于研究性别控制机制，也可为性别确定提供分子依据。邱涛用RAPD技术识别中华绒螯蟹的性别，200个引物中有17个引物扩增出群体水平的差异，其中一个引物(OPM14)扩增出个体水平的差异：雄性有一个800bP的特异带，而雌性没有。这可作为有价值的性别鉴别标记。

2.5监测遗传渗入，维持物种遗传多样性

目前，人为的养殖活动、人工放流等使得虾、蟹类种内不同种群间非自然的遗传渗入已相当普遍，应引起重视，需加以监测并收集数据，为保护种质资源、维持物种遗传多样性提供依据。李思发等用RAPD指纹标记研究中国大陆六水系绒整蟹的亲缘关系，引物OPP17扩增的947bP片段的出现频率，在长江、黄河、辽河三群体中显著地从南到北递减，长江蟹87.5%、黄河蟹41.66%、辽河蟹10.83%。这一遗传渗入的度量可作为区别三水系中华绒螯蟹的判据。邱涛等用RAPD方法研究中华绒螯蟹长江、辽河、瓯江水系三群体的遗传多样性，并未发现三群体间存在特征性条带，但群体间差异大于群体内差异。未发现群体间的分子遗传标记，但三群体间确实存在差异，表明近来种质资源混杂，遗传渗入是其中原因之一。

RAPD标记可用于群体遗传学研究，检测种群内、种群间的遗传多样性水平，并为种群识别提供可靠的遗传标记。Bardakci等用RAPD技术评估了罗非鱼的种群内、种群间的遗传变异度。Bielawski等进行了太平洋海岸条斑鲈的RAPD分析。Caccone等对欧洲尖吻鲈的DNA多态性进行RAPD—PCR分析。Garcia等尝试在斑节对虾中用RAPD分析不同地理群体间的遗传多态性，并就其在虾类选育中的应用作了初步探讨。王绕梅等用RAPD技术检测野生鲫鱼和四个金鱼代表种的基因组DNA多态性。张德春用该技术对湖北、广西两个鲢鱼人工养殖群体进行了遗传多样性的比较研究，为链鱼人工繁殖的科学规范提供一定的理论依据。张四明等进行了中华鲟随机扩增多态性DNA及遗传多样性研究，结果显示中华鲟天然群体核DNA水平的遗传多样性较低，从而为中华鲟资源的监测和保护提供了理论依据。石拓等用该技术对中国对虾朝鲜半岛西海岸群体的基因组DNA多态性进行了检测，表明该对虾群体的遗传多样性水平较低。宋林生等对日本对虾野生群体和养殖群体的遗传结构的RAPD标记进行了初步的研究，并认为将RAPD以及其他分子标记技术用于海洋动物的育苗育种中，进行标记辅助育种，是海洋动物增养殖健康发展的有力保证。

RAPD技术程序简单快捷，且无需事先确定目的基因的序列，无种属特异性，有无数的引物可供利用，能产生足够的多态性，无需同位索，可以鉴别物种之间和种群之间的基因组的差异，也可区分个体之间的差异。为此，许多从事水产育种工作的科研人员已把RAPD技术应用到水产遗传育种上，并已取得—定的成果。在海水鱼类(如大黄鱼等)、海水虾类的种质资源研究中，由于同工酶所揭示的种内水平上的遗传差异水平非常低，而RAPD比同工酶更能指示DNA多态性，因此RAPD分子标记在鱼类、虾类、蟹类种质资源遗传学研究中有着广泛的应用前景。目前RAPD分析主要应用于标记鉴定、遗传作图、系统发育和进化及亲缘关系的研究、种群的划分、群体遗传多样性研究等。但在实际应用中，RAPD也表现出不足，如显阳性位点，在后代中不能区别是纯合体还是杂合体；稳定性较差；高度的变异性等缺点。当然有些是可以避免的，解决的方法是对单链引物进行筛选，优化反应条件，但第一个缺点是无法避免的。如能把RAPD与其它分子标记如RFLP、AFLP和微卫星等结合使用，RAPD仍将会发挥更好的用途。总之，随着生物技术的不断发展和更多应用，RAPD技术也将更加完善，应用更加广泛。

RPAD特点 与PCR相比，具有以下几个特点：①RAPD使用的是随机引物，不需要预先了解目的的基因和相应的序列。②操作简便，实验周期短，能在较短的时间筛选大量样品。③引物具有普遍适就性，适用于自动化操作分析。

与RFLP相比，具有以下特点：①RAPD分析只需要少量模板，一次扩增仅需20-100ng，这对于DNA量很少的材料进行基因组分析有利。比如对花粉粒、原生质体、种子等的DNA分析是切实可行的。②RAPD标记具有更大的随机性，亦有利于图谱的构建。对于DNA含量大的和多倍体物种，RFLP探针会与多倍体的多个片段杂交，所得到的混合指纹会对其它等位基因的阐明带来困难。而且由于DNA量较大，进行单拷贝的Southern杂交不很实际，至少需要很长的曝光时间，并且已知的探针数量有限。RAPD大大增加了可构建遗传图谱物种的数量。③无需借助于有伤害性的同位素，耗费的人力物力少。④灵敏度高。引物中的个别碱基的变化会引起扩增条带和强度的剧烈变化，这是RFLP所无法比拟的。⑤RAPD标记可以覆盖整个基因组，包括编码和非编码区，可以反映整个基因组的变化。⑥RAPD产物有大于50%的条带扩增于单拷贝区，经过克隆和序列分析后，可作为RFLP和原位杂交的探针，在基因定位、克隆及辅助选择育种中可以广泛应用。

六、RAPD分析的优越性和不足

RAPD是一种全新且有效的遗传标记，与其他分子标记相比，具有许多优越之处：

①合成一套引物，可用于不同生物基因组的分析。相对来说，RFLP标记具种族特异性，这限制了其应用。

②RAPD技术简便易行，省力省时。不需要RFLP分析的预备工作，如克隆制备、同位素标记、Southern印迹和分子杂交。并且RAPD检测灵敏方便，用荧光染料或同位素标记均可检测，这大大增加了其分析速度。即使用序列胶来分析RAPD，单独一人仅用36小时便能完成120个样品的分析，而RFLP至少要花一周时间。

③RAPD分析所需样品DNA量极少。仅为RFLP的1/1000～1/200，这对于生物早期取样鉴定或DNA受限制的情况大有益处。

④由于RAPD用于构建基因图谱时不需要克隆，这可打破克隆载体和宿主的限制，扩大了应用范围。

⑤每个RAPD标记相当于基因组分析中的靶序列位点，这对共同协作的研究项目，可简化信息的转移过程。

⑥RAPD标记可以对那些RFLP难以区分的基因组区域作出遗传连锁图。⑦RAPD分析能自动化，减少了象RFLP那样的麻烦手续。

然而，RAPD标记也存在某些不足。比如，RAPD标记难以区分开杂合子和纯合子基因型，不能有效的鉴别出杂合子。另外，RAPD反应易受外界因素影响，重复性不太令人满意，等等。因此，使RAPD实验条件标准化就很重要了。Black（1993）综述了一些影响条带的书目、大小和强度的因素，其中包括PCR缓冲液。dNTP和Mg2+浓度、循环参数（退火温度、变温时间、PCR仪）、Taq聚合酶来源（Schierwater和Ender，1993）、DNA条件和含量（Black等，1993）。

七、RAPD技术本身存在的问题及对策

RAPD技术是由多种成分参加的生化反应，反应中各种成分均为微量，尽管其反应灵敏度高，但是影响因素较多，会出现重复性差等一些问题。为了得到较稳定的结果，各种反应参数必须事先优化选择，操作中每一步都必须小心谨慎，以防止出现差错。

温度 RAPD一般反应条件是：变性92-95℃，常用94℃，30-60s;延伸72℃，60-120s;退火35-37℃，30-60s。变性和延伸温度一般没有太大变化，而退火温度影响较大。退火温度低，引物和模板结合特异性较差，出现的条带可能增多;退火温度高，引物和模板结合特异性增加。有人提出，在寻找基因差异为目的的实验中，退火采用33-34℃效果更好。在优化方案中，退火温度可能要提高，以便降低背景，得到少而清晰的"带"。温度的梯度率也是十分重要的，特别是退火与延伸之间的梯度尤为重要。各种仪器的控温、升降温性能均有差别，一些仪器(如一些旧型号的仪器)在到达特定的温度前就开始计时，一些PCR仪显示的温度与实际温度会有差异。这些在设计程序和结果分析时有必要考虑，所以注明所用仪器的生产厂家、品牌、规格，就显得很有必要，对于同一批实验，注意控制在同样的温度条件下进行反应，结果才有可比性。

反应物的影响 PCR扩增受多种成分的制约，产物仅在部分循环中呈指数式(2)增长，逐渐将达到一个平台期，模板是关键制约因素之一，RAPD产物取决于此，实验中非常精确的模板浓度是十分关键的一个步骤。浓度过低，分子碰撞机率低，偶然性大，扩增产物不稳定;浓度过高，会增加非专一性扩增产物。更重要的是，若循环数控制不好，引物过早消耗完，后面循环中，PCR扩增产物的3端会和原模板及每一次循环的扩增产物退火，造成不等长度的延伸。因此，如果原模板浓度过高，非专一性扩增产物就足以形成背景，这是高浓度模板造成弥散型产物的原因。相对而言，模板纯度影响不大，即反应液中蛋白质、多糖、RNA等大分子物质影响不大。理想的模板和引物浓度能产生多态性丰富、强弱带分明的RAPD图谱。引物3端的重要性似乎更大。此外，Mg+2浓度也影响反应的参数包括产物的特异性和引物二聚体的形成，人们在各自的实验中得出不同的结论，大约在1.5-4mmol/L范围内。总之，各种反应物的浓度应事先进行筛选优化。

污染问题 实验中应设空白对照，因为引物、各种缓冲液和双蒸水都会造成污染。而且Taq酶也可能出现污染，给分析带来困难，所以必须设置对照以排除系统误差。并且，酶也尽可能优化。

扩增条带的取舍 重复性问题 为了克服RAPD重复性差的问题，应设置重复实验。作为DNA多态性标记位点的条带是应该可重复的，重复性好是最重要的取舍指标，而带的强弱不应该作为取舍的指标。有学者认为带的强弱与其在基因组中的拷贝数有关。但据Thormann对十字花科植物分析，RAPD产物的强弱与该产物在基因组中的拷贝数无直接关系，而与引物及模板的同源性程度有关。分析一个位点时，要作全面分析，若某一个体的全部带均弱，其模板可能有问题(浓度、分子量);若某一个体的大部分带与其它个体强度一致，仅有一条或少数几条带弱，可能存在拷贝数差异。重复性不好的弱带(无规律出现的带)可能由非专一性扩增、产物间退火或其它人为因素造成，不能记录。

异源双链问题 Ayliffe研究亚麻锈病菌时发现F1代中出现的一条带在亲本中没有出现，进一步研究发现这一条带是由2个等位基因组成的异源双链形成的，这2个等位基因除中间插入的38bp的序列外，其余序列相同。在蜜蜂的研究中也发现了相似的问题，这种条带可以用单链核酸酶将其消除。也可以将电泳温度提高到60℃以上，使异源双链变性，以消除其影响。

非孟德尔遗传的条带 Heun等分析认为，在显示多态性的非模糊条带中有92.5%的表现为孟德尔显性遗传，其余的条带不符合孟德尔遗传，分析认为可能由不同的序列组成。一般实验中大多采用符合孟德尔遗传的条带进行分析。在连锁图谱分析中，基因型错误可以部分消除，即在F1代或1：1混合物中没有出现的条带，在其父母本中应尽可能去掉。

同一条带的同源性问题 Thormann将RAPD产物标记作探针，杂交结果表明，与探针片断迁移率一致的带有时并不同源，这种情况仅发生在种间。并比较了RFLP和RAPD标记在种内和种间得出的结果，发现RFLP和RAPD标记在种内水平的结果完全吻合，但在种以上等级的结果相差甚远，这说明在电泳结果的同一个带中，有可能存在序列不同但分子量相同的几条带，RAPD无法检测。这种可能在种内较少发生，而这种间可能性较大，Castagna用RFLP和RAPD比较研究也得出了相同的结论。

电泳分辨率问题 电泳时，基因组不同位置的扩增产物共同移动的可能性是有的，即不同分子量的扩增产物可能在电泳时没有分开而形成一条带，凝胶分离系统和基因组的亲缘关系有可能提高这种概率。一般而言，聚丙烯酰胺和银染的分辨效果比琼脂糖和溴化乙铵要高，用较长(可达到20cm)或浓度更高(2%)的琼脂糖凝胶有助于提高分辨率。当然，随着分辨率和灵敏度的提高，更可能出现实验误差。所以有人评述：最保险而简单的方法是用琼脂糖电脉分离而且只注意那些无疑而重发性高的带。但是，聚丙烯酰胺和银染所揭示的高信息量的多态性无疑可加快分子标记的鉴定过程。

显性标记问题 RAPD标记来自于模板DNA的复制，经过30一40次循环，扩增条带数量理论上可达2。原模板中扩增位点是纯合还是杂合已无法判断，因为纯合位点的扩增条带只相当于杂合位点的2倍，电泳时无法检测到其差别。杂交中。如果亲本一方为纯合体，F1代就可以全部表现出该条带;如为杂合体，该条带在F1中应为l：l分离，即一半后代有该条带，而另一半则没有。当然来自于多拷贝区的条带分析更为复杂。