| 词条 | 分子生物学技术 |
| 释义 | § 分子生物学技术简介 随着生命科学和化学的不断发展，人们对生物体的认知已经逐渐深入到微观水平。从单个的生物体到器官到组织到细胞，再从细胞结构到核酸和蛋白的分子水平，人们意识到可以通过检测分子水平的线性结构（如核酸序列），来横向比较不同物种，同物种不同个体，同个体不同细胞或不同生理（病理）状态的差异。这就为生物学和医学的各个领域，提供了一个强有力的技术平台。目前，常用的分子生物学技术有如下几种。 PCR单链构象多态性分析 PCR- 单链构象多态性分析(PCR- single strand conformation analysis, PCR- SSCP) 是近年来在基因突变检测中运用最广泛的方法之一。PCR- SSCP 技术凭借突变可引起单链DNA三级构象改变, 通过观察单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率漂移来判断突变。样品经PCR 扩增后, 其产物经变性后可以产生2 条单链, 如果存在基因突变, 哪怕是一个碱基的异常, 单链的构象也会发生变化, 正常与突变的DNA单链在聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE) 中, 可以显现出不同的带型, 从而确定野生型和突变型, PCR- SSCP 分析的主要优点是简易且敏感性较高。但是该技术不能确定突变的部位和性质。PCR- SSCP 突变检测敏感性随PCR 产物长度的增加而降低,一般用于检测较小外显子的突变。有时由于单个核苷酸变化所引起的构象改变很小, 用PAGE 电泳就可能无法检出, 在PCR 产物或待测DNA 小于200 bp 时, PCR- SSCP 分析能够检测出70%~ 95%的突变。如果以毛细管电泳代替PAGE, 则可大为提高突变检测的效率。 Wallace1997 年提出将PCR- SSCP 和异源DNA双链分析( heteroduplex analysis, HA) 相结合, 称之为SSCP/ HA, 部分PCR 产物经变性进行SSCP 分析以了解是否具有突变, 其余PCR 产物直接用于电泳, 以检出含有突变的异源DNA双链, 电泳凝胶经银染, 单链DNA所形成的带为橘黄或棕色, 而双链DNA则表现为灰黑色。该综合手段可以单链构型多态性和异源双链构型分析两个不同的层次检出突变, 是一种经济、迅速的突变检测手段, 但无法提供突变位置的信息。 PCR- SSCP 有许多改进技术, 如RNA单链构象多态性法( PCR- rSSCP)、双脱氧测序单链片段构象多态分析( PCR- ddF)、限制酶指纹技术( PCR- REF) 等。PCR- rSSCP 法依据RNA构象对单个碱基替代更敏感的原理, 在PCR 引物上加上某类启动子, 通过转录的RNA构象体的电泳迁移差异进行突变鉴别。PCR- ddF 法把PCR 产物转录, 将转录物用反转录酶进行Sanger 双脱氧终止测序反应, 通过观察非变性胶上经解链处理所产生的单链漂移、突变后终止片段的获得与缺失来判断突变。PCR- REF 法将RFLP 和SSCP 技术优势组合, 将PCR 扩增的待测片段用5~ 6 种限制酶依次消化, 混合并进行末端标记, 最后经变性处理并在非变性凝胶上电泳分离, 从而获得来自片段长度和片段构象的双重突变信息。 变性梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 利用由碱基序列所决定的DNA片段溶解度或变性度的差异, 达到分离野生型与突变型DNA片段的目的, 该手段分辨率达一个碱基。当DNA 双链沿变性剂浓度梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶迁移时,DNA分子中解链温度( Tm) 低的部分逐渐变性解链。一般总是错配碱基部分的异源双链Tm最低, 最容易解链, 其次是富含AT 碱基对的部位, 富含GC碱基对的部位Tm值较高所以解链较难。因此, 正常DNA双链和异源双链在梯度变性胶中电泳时, 异源双链总是先解链。将PCR 产生的双链DNA在浓度递增的尿素和甲酰胺变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳, 当某一DNA片段迁移到变性剂浓度与其最低Tm相当的位置时, 该片段低温解链部分的双链打开, 部分解链导致DNA迁移速度明显下降, 观察样品的迁移率变化即可判断是否存在变异。DGGE 敏感性高, 即便异源双链中仅含一个错配碱基, 在电泳时也可分辨其迁移率的改变。DGGE 方法的单碱基突变检出率在DNA片段长度600 bp 以内可以达到95%。 DGGE 的成功有赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移率的改变。但在相当于最高Tm的变性剂浓度的位置, 相应的DNA片段可能全部解链, 使试验无法检出存在于高Tm DNA片段中的碱基替换。为了解决此问题, 可以在一个PCR 引物的5 ' 端设计一段富含GC的尾巴, 从而使PCR 扩增产物的一端富含GC 碱基对, 保证了绝大多数DNA片段不会发生完全解链, 在最高变性剂浓度区域仍然可以分辨出部分解链的异源双链, 这一改进使DGGE 的突变检出率接近100%, 但DGGE 只能检测突变是否存在而不能确定突变的位置。 DGGE 方法需要设计特定片段最佳的PCR引物以及最佳变性条件, 这一过程比较复杂, 梯度变性胶的制备需要的设备较昂贵, 所以在常规实验室不易实施。 双链构象多态分析法 双链构象多态分析(double- strand conformation analysis, DSCA) 是利用荧光标记引物, 通过PCR 扩增出相关的研究片段作为荧光标记参照( fluorescence labeled reference, FLR)DNA分子。然后, 用标记参照物FLR 分子与待测PCR扩增片段进行杂交。因为FLR 和样本核苷酸序列相似, 杂交反应液中所有DNA的正链和反义链之间将形成双链结构。只有与带荧光标记的FLR 分子正链匹配的DNA双链, 经过电泳后方可被DNA测序仪的激光检测系统所检测。所以, 可检双链均有一样的FLR 正链, 杂交双链的电泳迁移率可能相同,但是由于反义单链的差异双链变性程度的差异而最终造成电泳迁移率的不同。不像SSCP 技术, DSCA能够任意操纵变性双链的形成,选用不同的FLR可以达到难分样本的最佳分离效果。另外, 通过调整FLR 和样本待测DNA分子的比例, 可专一性增强杂交异质双链信号并减弱纯合双链信号。DSCA技术的优点还在于它依据样品经过固定检测仪的时间差, 而非相同电泳时间迁移的距离差来判断突变的有无, 这样就避免了诸如SSCP 等技术分析中因迁移速率差异而降低的泳动速度慢的条带检测率。另一方面, DSCA的有效检测片段长度可达1 kb。由于激光系统的介入, DSCA的灵敏度和上样量分别得以提高和降低, 不到1 秒的泳动差异也足以检测。该技术已被成功地用于囊性纤维化基因( cystic fibrosis gene) 的4 种突变, 以及HLA Ñ型基因中131 种等应基因的检测。 变性- 高压液相色谱分析 变性- 高压液相色谱(denaturing high- performance liquid chromatography, DHPLC) 是利用DNA构型改变检测基因突变和遗传多态性的方法之一, 其可以检测单核苷酸多态和可遗传的突变。实验主要过程包括PCR 扩增待测和正常DNA样品, 将扩增产物变性后再复性, 若存在突变, 在这一复性过程中可形成异源双链。在部分变性条件下, 高压液相色谱分析可以有效地区分由变异碱基与正常碱基形成的异源DNA双链和正常DNA双链。由于DHPLC 的分辨率可达到1bp/ kb, 而且操作过程可以全部程序化、大规模化和自动化,使得实验时间大大缩短, 实验准确率提高, 可作为大群体任何基因突变初筛的有力手段, 比SSCP 有更多的优越性, 具有广泛的应用前景, 许多工作都已经证实了DHPLC的敏感性、有效性和准确性。 特异性等位基因扩增 等位基因特异性扩增法( allele- specific amplificarion, ASA) 是基于PCR技术的一种单核苷酸突变检测法, 是分析已知碱基替代或微小片段缺失和插入型突变的常规技术。在PCR 的引物设计中, 根据已知突变位点性质在引物3 ' 端或中间设计一错配碱基, 使之仅能与突变型或野生型基因互补而只扩增突变型或野生型基因。 ASA技术只需一步PCR反应, 甚至无需电泳和标记技术。因其快速, 重复性强, 耗资少, 无同位素污染以及高效性等特点, 将成为有前途的适应于人群大规模突变筛查的方法。应用该方法最好避免错配碱基为G: T, 这种错配可能引发扩增反应。 化学裂解错配碱基法 化学裂解错配碱基法( chemical cleavage mismatch, CCM) 通过化学修饰并切割异源DNA双链中错配碱基, 达到检测点突变的目的。其原理是末端标记的DNA片段暴露于可以识别并修饰异源双链中错配碱基的化学试剂中(如错配的胞嘧啶可被羟胺修饰, 错配的胸腺嘧啶可被四氧化锇修饰) , 被修饰的位点随即可被杂氮环已烷等化学物质裂解。DNA修饰裂解后, 电泳观察DNA片段长度即可知道突变是否存在。该技术较其他突变检测系统有更多的优越性, 可以扫描1~ 2 kb 的大片段DNA并在随后的顺序分析中定位突变位点, 其效率可达100%。该手段通常首先对目标DNA和野生型DNA进行PCR 扩增, 然后对野生型DNA扩增片段进行末端标记, 标记片段作为探针与目标序列复性形成异源双链, 用四氧化锇( OsO4) 或羟胺(hydroxylamine) 修饰并用哌啶( piperidine) 切割, 聚丙烯酰胺电泳分离不同长度的片段。近年来, 有人采用碳化二亚胺作为错配修饰剂, 进一步提高了该方法的敏感性。CCM方法最初采用同位素DNA片段, 用荧光标记代替同位素后, 称之为荧光化学裂解错配碱基法( FCCM) , 该方法依然比较敏感并且安全, 可检出95%~ 100%的错配。化学裂解错配碱基法的不足之处在于工作量大, 需要使用有害化学物质作为试验用试剂。[1] § 分子生物学技术的应用 分子生物学技术：可应用于遗传性疾病的研究和病原体的检测及肿瘤的病因学、发病学、诊断和治疗等方面的研究提高到了基因分子水平。 生物学定义：生物学是研究生命现象和生物活动规律的科学。 据研究对象分为动物学、植物学、微生物学、古生物学等；依研究内容，分为分类学、解剖学、生理学、细胞学、分子生物学、遗传学、进化生物学、生态学等；从方法论分为实验生物学与系统生物学等体系。 § 注 提高到了基因分子水平。 |
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