| 词条 | RAPD |
| 释义 | § 概述 运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。 RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。[1] § 原理 RAPD，即随机扩增多态性DNA技术，是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。它的应用是基于这样的一个推理：对于同一模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。 90年代前期RAPD技术得到广泛的应用，几乎所有的作物都有这方面的研究报告。但随着研究的深入，人们发现该技术存在一定的缺陷，并对此作了一些探索。 § 特点 RAPD 技术目前运用相当广泛， 几乎渗透于整个基因组研究的各个方面， 这与它所具有的众多优势是分不开的。 ① 无需专门设计RAPD 扩增反应引物，也无须预先知道被研究生物基因组的核苷酸序列，引物可随机合成和随机选定，长度一般为9- 10 个核苷酸； ② 每个RAPD 反应中，仅加单个引物，就可通过引物和模板DNA 随机配对实现扩增，扩增无特异性； ③ 退火温度低，一般为36℃，这样的温度能保证核苷酸引物与模板的稳定结合，同时允许适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，使RAPD 有较高的检出率； ④ RAPD 技术简便易行、省时省力，不需要RFLP 分析的预备性工作：如克隆的制备、同位素标记、Southern 印记反应及分子杂交。RAPD 易于程序化，利用一套随机引物可得到大量的分子标记，并可借助于计算机系统进行分析； ⑤ RAPD 分析所需的DNA 样品量极少，仅为RFLP 的1ö 1000 - 1ö 200，这对于生物早期取样鉴定或在DNA 受限制的情况下是十分有利的。 § 试验条件 1. 药品试剂 模板DNA（10～100ng） 寡核苷酸引物（20mmol/L贮存液，可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司购买，也可以自己合成） RAPD分析软件 0.2 mmol/L dNTPs（必须使用高质量的dNTPs，这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解，因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等） Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut） 10×PCR缓冲液（500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L Tris•HCl, pH 8.3） 矿物油 电泳所需试剂 2. 仪器设备 PCR扩增仪 电泳装置 微量离心机 微量移液器（1～20ml和20～200ml） 0.5 ml Eppendorf管 紫外线观察装置及照相设备 § 操作程序 （1）在冰里向无菌的Eppendorf管中加入以下反应物： 水 14.75 ml 10×缓冲液 2 ml 10×dNTPs 2 ml 引物（20 mmol/L） 0.2 ml Taq DNA聚合酶 终体积 DNA（10～100ng） 1 ml 石蜡油 20ml （2）93℃反应2 min后开始如下循环： 93℃变性反应1min 36℃退火反应1min 72℃延伸反应1.5min 经过45个循环后，最后一个循环72℃增加5min，循环结束后反应产物置于4℃保存。 （3）20ml反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况。 § 试验注意及解决方法 （1）扩增偏差或无扩增。 ――在部分或全部管中缺少一个组分。重复少量几个反应以确定所有的PCR组分是否都已加入。 ――PCR抑制物可能与DNA一起纯化，改变DNA的浓度。 ――在DNA分离中加入一个清洗步骤（如苯酚抽提）。 ――稀释新的DNA溶液。 ――引物母液失效。重新配制母液，使用不同的引物或提高引物浓度。 ――延长退火时间（在PCR程序中的第二部分），或降低升温转换步骤之间的速率。 ――提高每个反应中的Taq聚合酶的浓度。 ――补加新的组分，该灭菌的都高压灭菌。 （2）扩增结果差，条带模糊或难以辨认。 ――更换Taq聚合酶缓冲液。 ――检查引物（使用另外一个引物，或者将引物末端标记，在16% 6mol/L尿素聚丙烯酰胺胶上电泳检测）。 ――检查Taq聚合酶活性（与不同批量的酶作比较）。 ――改变DNA浓度。 （3）高相对分子质量产物弥散状分布>4kb。 ――降低DNA浓度。 ――降低Taq聚合酶浓度。 ――减少凝胶上样量。 ――可能是由于循环数过多的结果（Bell和Demarini 1991），减少循环数。 ――确认是否使用正确的缓冲液（不是水！）制备凝胶。 ――在较低的电压下电泳。 （4）在对照和所有检测样品中均为一条很强的单一带。 ――确认引物序列不是回文结构。这可能是引物多聚体造成的结果。使用不同的引物。 （5）带谱不可重复。 ――DNA过多或过少。把基因组DNA浓度控制在10～100ng范围之内，DNA量太少时，“真正”靶序列与引物的结合效率低，因此引物扩增会产生假的条带，这就称为引物伪迹；DNA量太多会导致错误配对（指引物与基因组DNA的配对）。每个样品进行两个不同DNA浓度的反应。 ――只考虑主要条带。 （6）染色后凝胶背景太强影响分辨率。 ――减少染色时间。 ――凝胶脱色时间延长。 ――PCR反应中DNA含量或Taq聚合酶过多。 （7）低相对分子质量产物分离不充分。 ――在更高浓度的琼脂糖凝胶、专业纯凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上分离产物。 § 技术问题及对策 RAPD技术是由多种成分参加的生化反应，反应中各种成分均为微量，尽管其反应灵敏度高，但是影响因素较多，会出现重复性差等一些问题。为了得到较稳定的结果，各种反应参数必须事先优化选择，操作中每一步都必须小心谨慎，以防止出现差错。 1 温度 RAPD一般反应条件是：变性92－95℃，常用94℃，30－60s；延伸72℃，60－120s；退火35－37℃，30－60s。变性和延伸温度一般没有太大变化，而退火温度影响较大。退火温度低，引物和模板结合特异性较差，出现的条带可能增多；退火温度高，引物和模板结合特异性增加。有人提出，在寻找基因差异为目的的实验中，退火采用33－34℃效果更好。在优化方案中，退火温度可能要提高，以便降低背景，得到少而清晰的＂带＂。温度的梯度率也是十分重要的，特别是退火与延伸之间的梯度尤为重要。各种仪器的控温、升降温性能均有差别，一些仪器（如一些旧型号的仪器）在到达特定的温度前就开始计时，一些PCR仪显示的温度与实际温度会有差异。这些在设计程序和结果分析时有必要考虑，所以注明所用仪器的生产厂家、品牌、规格，就显得很有必要，对于同一批实验，注意控制在同样的温度条件下进行反应，结果才有可比性。 2 反应物的影响 PCR扩增受多种成分的制约，产物仅在部分循环中呈指数式（2）增长，逐渐将达到一个平台期，模板是关键制约因素之一，RAPD产物取决于此，实验中非常精确的模板浓度是十分关键的一个步骤。浓度过低，分子碰撞机率低，偶然性大，扩增产物不稳定；浓度过高，会增加非专一性扩增产物。更重要的是，若循环数控制不好，引物过早消耗完，后面循环中，PCR扩增产物的3端会和原模板及每一次循环的扩增产物退火，造成不等长度的延伸。因此，如果原模板浓度过高，非专一性扩增产物就足以形成背景，这是高浓度模板造成弥散型产物的原因。相对而言，模板纯度影响不大，即反应液中蛋白质、多糖、RNA等大分子物质影响不大。理想的模板和引物浓度能产生多态性丰富、强弱带分明的RAPD图谱。引物3端的重要性似乎更大。此外，Mg＋2浓度也影响反应的参数包括产物的特异性和引物二聚体的形成，人们在各自的实验中得出不同的结论，大约在1.5－4mmol/L范围内。总之，各种反应物的浓度应事先进行筛选优化。 3 污染问题 实验中应设空白对照，因为引物、各种缓冲液和双蒸水都会造成污染。而且Taq酶也可能出现污染，给分析带来困难，所以必须设置对照以排除系统误差。并且，酶也尽可能优化。 4 扩增条带的取舍 RAPD扩增图重复性问题 为了克服RAPD重复性差的问题，应设置重复实验。作为DNA多态性标记位点的条带是应该可重复的，重复性好是最重要的取舍指标，而带的强弱不应该作为取舍的指标。有学者认为带的强弱与其在基因组中的拷贝数有关。但据Thormann对十字花科植物分析，RAPD产物的强弱与该产物在基因组中的拷贝数无直接关系，而与引物及模板的同源性程度有关。分析一个位点时，要作全面分析，若某一个体的全部带均弱，其模板可能有问题（浓度、分子量）；若某一个体的大部分带与其它个体强度一致，仅有一条或少数几条带弱，可能存在拷贝数差异。重复性不好的弱带（无规律出现的带）可能由非专一性扩增、产物间退火或其它人为因素造成，不能记录。 异源双链问题 Ayliffe研究亚麻锈病菌时发现F1代中出现的一条带在亲本中没有出现，进一步研究发现这一条带是由2个等位基因组成的异源双链形成的，这2个等位基因除中间插入的38bp的序列外，其余序列相同。这种条带可以在后代中遗传，在该研究中这种条带大约占0.16％。在蜜蜂的研究中也发现了相似的问题，这种条带可以用单链核酸酶将其消除。也可以将电泳温度提高到60℃以上，使异源双链变性，以消除其影响。 非孟德尔遗传的条带 Heun等分析认为，在显示多态性的非模糊条带中有92.5％的表现为孟德尔显性遗传，其余的条带不符合孟德尔遗传，分析认为可能由不同的序列组成。一般实验中大多采用符合孟德尔遗传的条带进行分析。在连锁图谱分析中，基因型错误可以部分消除，即在F1代或1：1混合物中没有出现的条带，在其父母本中应尽可能去掉。 同一条带的同源性问题 Thormann将RAPD产物标记作探针，杂交结果表明，与探针片断迁移率一致的带有时并不同源，这种情况仅发生在种间。并比较了RFLP和RAPD标记在种内和种间得出的结果，发现RFLP和RAPD标记在种内水平的结果完全吻合，但在种以上等级的结果相差甚远，这说明在电泳结果的同一个带中，有可能存在序列不同但分子量相同的几条带，RAPD无法检测。这种可能在种内较少发生，而这种间可能性较大，Castagna用RFLP和RAPD比较研究也得出了相同的结论。 5 电泳分辨率问题 电泳时，基因组不同位置的扩增产物共同移动的可能性是有的，即不同分子量的扩增产物可能在电泳时没有分开而形成一条带，凝胶分离系统和基因组的亲缘关系有可能提高这种概率。一般而言，聚丙烯酰胺和银染的分辨效果比琼脂糖和溴化乙铵要高，用较长(可达到20cm)或浓度更高(2%)的琼脂糖凝胶有助于提高分辨率。当然，随着分辨率和灵敏度的提高，更可能出现实验误差。所以有人评述：最保险而简单的方法是用琼脂糖电脉分离而且只注意那些无疑而重发性高的带。但是，聚丙烯酰胺和银染所揭示的高信息量的多态性无疑可加快分子标记的鉴定过程。 6 显性标记问题 RAPD标记来自于模板DNA的复制，经过30一40次循环，扩增条带数量理论上可达2。原模板中扩增位点是纯合还是杂合已无法判断，因为纯合位点的扩增条带只相当于杂合位点的2倍，电泳时无法检测到其差别。杂交中。如果亲本一方为纯合体，F1代就可以全部表现出该条带；如为杂合体，该条带在F1中应为l：l分离，即一半后代有该条带，而另一半则没有。当然来自于多拷贝区的条带分析更为复杂。 § 应用问题及策略 1 遗传图谱构建的问题 RAPD是一种显性标记，符合孟德尔遗传定律，不能区分杂合型和纯合型，因此在遗传分析及遗传图谱的构建等一些方面受到限制。目前，在实践中，主要利用了以下2种方法。 ①利用单倍体 利用胚乳进行RAPD分析，可以克服构建遗传图谱中这些困难。因为针叶树的胚乳是单倍体，记录了杂合的母本染色体组在减数分裂过程中的遗传事件，不存在杂合型，进行RAPD遗传分析时，与共显性标记具有同样的遗传行为，是天然的优良作图材料。现在已进行遗传图谱构建的有湿地松、欧洲赤松、火炬松、杨树、日本柳杉和桉树。但是由于缺乏细胞遗传学的研究，暂时还不能确定连锁群和染色体之间的对应关系。 ②将RAPD条带作为单剂量标记，单剂量标记(Single-dose RAPD markers)是从两物种和其杂交产生F1代的分子标记中选择的。选择构建图谱用的标记有2个原则：A、它们必须在一个亲本中存在而在另一个亲本中不存在；B、它们在后代中必须以l：1分离。这种方法相当于一个杂合体和一个隐性纯合体的测交，称为双向假测交(Two-way pseudo-testcross)。在多倍体植物中，不论基因组是如何组成的(异源多倍体或同源多倍体)，也不论材料的多倍性水平如何，单剂量的标记都相当于简单的等位基因(同源多倍体)或相当于二倍体基因座上的杂合等位基因(异源多倍体)。因此根据这些单剂量标记的连锁情况可以构建分子图谱。RAPD条带作为单剂量标记使那些基因组DNA含最大，世代周期长的乔木和多倍体植物的遗传图谱研究走出了几乎停滞的状态。Grattapagalia利用这种策略首先构建了巨桉和尾叶桉的分子连锁图谱。Conner利用这种策略构建了3个苹果品种的分子图谱。Mudge利用甘蔗及杂交后代的RAPD条带作为单剂量标记进行连锁分析构建了甜根子草的51个连锁群，并分析了其染色体组的数目。虽然这些连锁图谱是个体特异性的，但可以为数量性状定位提供框架结构，为标记辅助选择育种奠定基础。 2 系统学研究中的问题 DNA扩增系统学是RAPD研究最为迅速的领域，许多作物都用RAPD作过亲缘关系分析，大部分结果和形态分类结果相类似，仅有少数例外。但是近年来，有人对其结果的可靠性提出不同的看法，主要有以下几点： ①由于引物的竞争性等，基因组的RAPD位点有时不能全部检出，造成假象上的差异。根据这种情况，可以认为，RAPD可以应用于种间乃至近缘属之间关系的研究，但有一定的局限性。因不同种度的扩增产物难以作同源性分析，只能作表征分析，从而只能从相似性或遗传距离上去分析亲缘关系。其结果可能与真实的系统关系相左。 ②因RAPD在种间或属间的变异水平很高，取样代表性是一个较大的问题，即利用某一个体代表一个种或用一个种代表一个属都可能造成结果的偏差。因而，最好能找到群体特异或种特异性的条带。 ③在表征分析中另一个值得注意的问题是一些RAPD产物的出现存在相关关系，即一个位点与另一个位点相连锁。若将这个差异单独计算，相当于对某一性状极度加权。 ④在系统发育学分析中，因为RAPD条带具有显性的遗传特征，多态性信息量较低。如果其符合二歧分枝树的假定，就可以对变化的性状予以加权，并进行分析。但是许多植物的核基因组是有性的二倍体，而且它们的进化历史是网状分枝树，不便于分析。通常认为叶绿体、线粒体和有些细菌及真菌的病原体符合二歧分枝树的假定。但由于其基因组较小，没有重组，它们的信息量只相当于核基因组中具有多个等位基因的一个同工酶座位，这样估算的基因多样性值的标准差理论上会比有多个核基因蛋白座位得出的大。其非编码区在一些动物类群中的进化速度很快，因此做种上水平研究时将会影响结果的准确性，但种下水平影响较小。 ⑤RAPD和农艺性状的系统分析比较说明，二者相差不大，没有出现相反的情况。而且RAPD比农艺性状提供了更多的遗传信息。 总之，用RAPD作系统分析应结合其它方法，结果才更有说服力。 3 标记、定位目的基因 标记、定位目的基因是相对较为缓慢的一个领域，这是因为RAPD标记探测的是整个基因组的变化，包括编码区和非编码区，要和基因位点联系起来有一定的困难。一般的变异群体性状的变化涉及到基因组内较大的范围(微效多基因)，RAPD不可能全部检出。而且RAPD检出的多态性又不一定是性状变异的标志(可能扩增于非编码区)。另一困难是RAPD扩增的特异性片段有些为重复序列，转化为RFLP探针有一定困难。据Grattapaglia用48个RAPD片段所作的杂交实验表明，有53%来自于低拷贝区(1000)。这只有通过筛选出与单拷贝区连锁的标记予以解决。如果RAPD标记和基因位点或性状不能联系起来，其实用价值就会大大降低。为此人们作了以下探索。 ①利用易位系、回复突变系、等位基因系、近交重组系等特殊材料 从理论上讲，除目的基因及邻近区域外，其它部分完全一致。如果检测出多态性，差异必定在目的基因及邻近区中，也就是说RAPD标记在这个范围内与目的基因连锁。但是要获得这些材料比较困难，例如等位基因系需要回交20代，时间太长。RAPD分析中一般用近等位基因系NILs(Near isogenic lines)，回交6代以上即可。回交6代时，供体DNA的比例为l/128，用RAPD找到的与目的基因连锁的标记与目的基因在距离上还相当远。 ②集团分离法(BSA)对不存在上述特殊生物模型的群体，可采用这种方法。即利用F2分离群体为材料，根据目的基因的表型把F2群体分为2群(例如抗病的和不抗的)，每一群中将各个体DNA等量混合，这样形成2个DNA混合池。在每个基因池中，不管群体性状如何，在目的基因的表型上都是一致的，2个群体之间，目的基因的表型都是相反的。因此，在2个群体之间完全不同、在每个群体之内各个体间又是完全相同的RAPD扩增产物即可认为是与目的基因连锁的RAPD标记。这种方法相当于把分析材料作为近等位基因系。 在找到合适的分子标记后，既可直接用于辅助选择育种(Molecule-marker assisted selection，MAS)，也可通过对特异片段的分离和两端测序将之转换为序列标志位点(Sequence-tagged sites，STS)。从这个分子标记出发找到目的基因需经过几个步骤：A、用稀有切点内切酶将基因组DNA切成大片断DNA；B、用脉冲电泳分离大片断DNA；C、将大片断DNA克隆到YAC(Yeast artificial chromosome)中，建立YAC文库；D、以显示多态性的扩增产物为探针从YAC文库中调出含有该RAPD标记和与其连锁的目的基因的大片断DNA；E、以该RAPD标记为起点向目的基因进行染色体滑步或跳跃，以找到目的基因。Michelmore首先利用这种方法找到了莴苣抗性基因的标记，Koller等利用这种方法找到与苹果疮痂病抗性基因有关的分子标记。 ③利用一套缺体一四体系或双端体系，以获得与目的基因连锁的标记引物进行扩增反应，然后进行原位杂交，确定特异性带在染色体上的位置。 这些工作在一些基础研究较多的领域或与人类关系较为密切的物种中进展较为迅速，比如小麦、水稻找到的RAPD分子标记已有许多。但林木等多年生植物研究进展稍迟滞，关键是缺乏合适的群体。 4 纯度和外源基因检验问题 虽然由于RAPD条带的灵敏和重复性等问题，纯度检验研究还只停留在实验阶段。但已有的对大麦、玉米、大豆、棉花、小麦、水稻的实验表明，RAPD技术是鉴定品种的有效方法。相信其在纯度检验和专利保护方面会取得较为广泛的应用。 § RAPD 技术与PCR 技术区别 PCR扩增仪RAPD 技术源于PCR 技术，但又不同于PCR 技术，差别主要体现在随机扩增引物上。首先，随机扩增引物是单个加入，而不是成对(正、反向引物) 加入， 其次， 随机引物短，一般RAPD 技术采用的引物含10 个碱基，由于随机引物较短，与常规PCR 相比，RAPD 退火温度较低，一般为35 - 45 ℃。 RAPD 技术以一系列随机引物对基因组进行检测，因而能检测多个基因位点，覆盖率比较大，并且引物越多，覆盖面越广，遗传信息也随之增加，因此RAPD 多态信息含量( PIC) 值波动较大，在0. 2 - 0. 9 之间。另外，RAPD 指纹呈孟德尔式显性遗传。 § 中药材鉴定中的作用 1. 植物药材相近种类的鉴定 邵鹏柱等在1994 年首次报道了对中药材人参与西洋参采用Ap2PCR 标记进行鉴别，他们采用20 个碱基的Galk ，Seq2 ，24 个碱基的MB forward ，MB reverse 和27 个碱基的OTCSbackward 作引物成功地利用AP2PCR 指纹图谱技术鉴定出人参和西洋参。1995 年分离人参属三种植物人参、西洋参、三七(P. notoginseng) 和四种伪品包括桔梗、紫茉莉、栌兰、商陆的基因组DNA ，分别采用10 个碱基的OPC25 和OPC220 作引物，用RAPD 标记可以明显地区别，说明DNA 分子也能区别人参属三个品种和人参及其伪品。中国南方部分省区有多种菊科不同属的植物如地胆草、一点红、苦荬菜、毛大子草、山莴苣、苦苣菜以“土公英”混作蒲公英使用。曹晖等利用Ap2PCR 和RAPD分子标记技术对蒲公英及六种土公英混淆品进行了DNA 指纹鉴别研究，结果显示它们的DNA 指纹图谱存在明显差异，利用这种差异可以从分子水平上鉴别蒲公英及其混淆品。Kohjyouma M 等采用CTAB 法提取菊科苍术属五种植物茅苍术、北苍术、单叶苍术、关苍术和白术等新鲜叶片组织的基因组DNA ，利用RAPD 技术获得了清晰的多态性DNA 指纹图谱，能明显地区分苍术的几个品种，发现在基因水平上单叶苍术与茅苍术十分接近，而与白术和关苍术相距较远，后两者与北苍术又相近似。这一结果与PFL P ( Restriction fragmentlength polymorphism) 方法得到的结果相近。说明RAPD 能有效地鉴别苍术属植物。 2. 植物药材基原的鉴定 转基因草类 Yamazaki M 等采用酸性缓冲液提取法分离了4 种菊科甘草属植物光果甘草、甘草、刺毛甘草和刺果甘草的基因组DNA ，通过对RAPD 指纹图谱分析，表明光果甘草与甘草遗传关系非常接近，刺毛甘草和刺果甘草的遗传关系相距较远，这种结果与RFL P 所得结果类似，也与植物分类学研究吻合。他们进一步对4 种商品甘草药材(新疆甘草、西北甘草、西伯利亚甘草、阿富汗甘草) 采用RAPD 方法作遗传距离估算，来对其进行基原鉴别，逐步证实了阿富汗甘草来源于光果甘草、西伯利亚甘草来源于甘草、新疆甘草和西北甘草来源于刺果甘草。曹晖等以CTAB 微量提取法分离菊科植物地胆草、白花地胆草和假地胆草以及四种商品苦地胆药材的基因组DNA ，采用长引MBforward(24 个碱基) ，GalK(20 个碱基) 进行AP2PCR 扩增和用OPC26 (10 个碱基) 的短引物进行RAPD 扩增，获得清晰可靠的DNA 指纹图谱，根据DNA带型差异鉴别出地胆草及其混淆品。同时通过对DNA 指纹图谱的相似度指数值计算， 证实四种商品药材苦地胆的基原为菊科植物地胆草。 3. 复方制剂、粉剂中药材品种的鉴定 中药材复方制剂、粉剂等由于其中的各种生药外观性状完全遭到破坏，要了解某味药是否存在，用传统的鉴定方法有时难以奏效。但是使用RAPD 技术时，从理论上来讲，如果只要能制备出该种药材的高度特异性的寡核酸引物，即可达到鉴定的目的。Ozeki 等采用GTC(异硫氰酸胍) 微量提取法分离人参属三种植物人参、西洋参和竹节参以及两种人参制剂高丽红参泡茶OTANECHAN(日本的一种人参组织培养物制成的茶) 的基因组DNA ，通过RAPD 分析，结果发现人参的根毛组织和干燥药材产生相同的RAPD 指纹图形，人参、西洋参和竹节参之间采用不同的引物产生不同的RAPD 指纹图；高丽红参泡茶中几乎没有DNA 片段扩增( 其提取物无DNA 模板之故) ， 但从OTANECHAN 中扩增到了与人参愈伤组织相同RAPD 指纹的DNA 片段。这表明了RAPD 技术应用于中药传统制剂中组分鉴别的可能性。黄璐琦等对来源于已于13 个种3 个变种的天花粉及其类似品共26 份样品，用8 个扩增多态性好的引物分别进行扩增，得到清晰、稳定的条带83 条，然后采取聚类分析的方法。结果表明全部样品可被有效地分为三大类：第一类是大宗商品和小宗商品，第二类是天花粉药材商品中极易混淆的湖北栝楼根和红花栝楼根，第三类全部是混淆品和地区习惯用药。对不同植物来源的天花粉，尤其是对来自不同组或组上水平的天花粉采RAPD 技术能够很好地把它们区别开来，其结果与物种间的亲缘关系基本一致。这为解决粉末及破碎药材的鉴定提供了新的方法。 4. 动物药材的鉴定 目前这方面的文献报道比较少。王义权等成功地将RAPD 技术应用于六种蛇类的基因组DNA的多态性检测，在20 个引物中找出16 个引物产生了253 个扩增片段，准确地区别了游蛇科5 个种和蝰蛇科1 个种，片段分布和片段共享度聚类分析所得的游蛇科5 种蛇之间的亲缘关系与染色体、颅骨和阴茎研究的结果基本一致。显示DNA 分子标记技术可以成为一种准确鉴别蛇类药材的新方法，RAPD 同样适合于动物中药材的鉴定。 5. 药材的野生类型与栽培品种的鉴定 由于生态环境的改变和人们生产活动的影响，中药材遗传特性及其生药品质在一定程度上产生了变化，产地和栽培也对生药品质和药性产生巨大影响。在人类回归自然呼声日益高涨的今天，人们普遍认为野生品比栽培品要好。同时，由于经济利益的驱使，以栽培品冒充野生品的现象时有发生，给临床造成混乱。因野生品和栽培品来自同一个物种，植物形态、药材性状、化学成分、生物活性等往往无明显差异，这就需要寻找一种有效的方法进行鉴别，RAPD 等分子标记的产生为这种鉴定提供了良好的应用前景。马小军等利用RAPD、A FL P 标记对人参、圆参与山参品种的研究中发现，RAPD、AFLP 标记可以用于野生与栽培品种的鉴别，其长脖类型更接近野生人参。 6. 道地药材鉴定 道地药材是人们在长期的临床实践中，经临床总结作为评价药材质量的综合标准。它是一种长期进化和生态适应过程中，某一物种的变种、生态型、品种或居群适应于特定的生态地理环境条件所形成的优良种质资源。道地药材的研究，包括其形成与鉴定，过去主要集中于化学、药理研究，从DNA 标记水平的报道很少。胡珊梅等用RAPD技术探讨泽泻道地药材与非道地药材之间遗传变异的大小， 并建立了道地药材的品质鉴定方法，为道地药材研究提供了有益的启示。可以预见，借助分子标记，对道地药材的快速、准确鉴定，无疑会给我们提供新思维、新视野。 § 分子生药学中的应用 目前，RAPD标记已被广泛应用于分子生药学各方面：RAPD分析样品①生物多样性：随着植物药研究的不断深入，可持续开发利用药用植物资源的问题越来越受到重视。应用RAPD技术进行药用植物生物多样性研究，可以在遗传多样性水平上了解天然产物多样性与物种、生态及地理分布的关系，挖掘潜在的药物资源，为开发新药寻找途径。RAPD方法可以检测物种的遗传多样性，探讨物种的亲缘关系和进化趋势。因此它是药用植物资源保护和种质资源保存的依据，特别是对濒危物种的研究更具有实际意义。 ②RAPD标记可用于生药分类，在DNA分子水平上鉴别生物不同种、亚种、变种甚至株。 ③RAPD标记可用来制作生物类生药系统发育关系上的树状图，特别是种内水平。这为生药亲缘进化关系,寻找新的药用资源开辟了新途径。 ④RAPD标记可用于构建基因图谱，进行基因定位，和对未知序列的DNA片段扩增与测序。 ⑤RAPD标记亦可用于遗传连锁图谱的构建，指导药用植物育种，防止品种间杂化和自交，选育优良性状的品种。 § 参考文献 [1] 培曦，邵鹏柱. 香港市售蒲公英及其混淆品蒲公英的DNA指纹鉴别研究[J ]. 中国中药杂志，1997 ，22(4) ：197. 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